Resumen de los factores proteicos implicados en el cultivo de células madre hematopoyéticas

Fuente: T&L Biotechnology Fecha de publicación: 13/07/2023

Introducción
En los últimos años, el uso de células madre en aplicaciones clínicas se ha generalizado. Sin embargo, la proporción y cantidad de células madre en el cuerpo humano es extremadamente baja, lo que impide satisfacer las necesidades clínicas. Por lo tanto, la expansión y el cultivo in vitro de células madre han cobrado cada vez mayor importancia. Por razones éticas y tecnológicas, el tratamiento con células madre aún enfrenta numerosos problemas. Los marcadores de superficie de las células madre/progenitoras hematopoyéticas y de diversos linajes de células sanguíneas son relativamente claros, y las características fenotípicas de las células pueden seleccionarse y separarse cuantitativamente, y sus funciones pueden ser relativamente libres, sin necesidad de complejos procesos posteriores como "andamios biológicos" para trasplantes nerviosos, vasculares y quirúrgicos. Por lo tanto, es el mejor modelo para la expansión y diferenciación de células madre, y también es conveniente para el uso clínico directo.
Las células madre hematopoyéticas poseen un alto grado de autorrenovación y múltiples potenciales de diferenciación. Pueden producir todas las células sanguíneas maduras, como glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y linfocitos, y reconstruir todo el sistema hematopoyético. La expansión in vitro de células madre hematopoyéticas requiere mantener su capacidad de autorrenovación a la vez que se previene su diferenciación, lo que la convierte en una tecnología muy compleja. En los últimos años, numerosos experimentos han demostrado que la diferenciación de las células madre hematopoyéticas depende de las citocinas. A continuación, resumiremos brevemente los factores y sus efectos utilizados en el cultivo de células madre hematopoyéticas.

Factor de células madre (SCF)
El factor de células madre (SCF) actúa anclando y expresando el receptor de tirosina c-Kit en la superficie de todas las células madre hematopoyéticas (CMH). La expresión deficiente de c-Kit disminuye la expansión de las CMH. Actualmente, casi todas las combinaciones de citocinas utilizadas en cultivos de CMH contienen SCF. Además, tanto SCF como FL3 pertenecen a la familia de receptores de tirosina quinasa (TKR), que ejerce un efecto sinérgico en la expansión de las células hematopoyéticas primitivas. Al unirse a un TKR específico, el SCF transmite señales a las células, iniciando la división y expansión tempranas de las células progenitoras, lo que permite que las células comiencen a expandirse e inhibe la apoptosis tras completar la fase G0.

Trombopoyetina (TPO)
Inicialmente, se creía que la TPO era un factor de crecimiento específico para los megacariocitos, perteneciente a la categoría de citocinas de acción específica que pueden mantener la expansión, diferenciación, maduración, división y formación de plaquetas funcionales en los megacariocitos. Es el factor predilecto para la expansión de los megacariocitos. En los últimos años, experimentos han confirmado que la TPO desempeña un papel importante en la promoción de la expansión de las CMH en estudios in vitro. Al combinarse con otras citocinas, puede aumentar el número total de unidades formadoras de colonias y el pliegue de expansión de las células madre CD34+. Especialmente en combinaciones con FL3, puede mantener el crecimiento y la expansión a largo plazo de las células madre CD34+ de sangre de cordón umbilical.

Interleucina-3 (IL-3)
La interleucina-3 (IL-3), también conocida como factor de crecimiento de mastocitos, es una citocina pleiotrópica producida principalmente por linfocitos T activados, que puede estimular la proliferación y diferenciación de células madre hematopoyéticas pluripotentes y células progenitoras de diferentes linajes. Tras la heterodimerización inducida por IL-3 de los receptores de superficie de las células madre, estos pueden unirse a numerosas proteínas de transducción de señales, como la vía del transductor de señalización y activador transcripcional de la cinasa Janus (JAK/STAT), estimulando así un flujo de señal regulado a la baja y participando en la regulación de la expansión de las células madre. La IL-3 también puede activar la vía de la cinasa regulada por señales extracelulares (ERK) y la vía de la c-jun aminotransferasa (JNK), induciendo el crecimiento, la expansión y la supervivencia de las células madre.

Interleucina-6 (IL-6)
La IL-6 es una citocina multidireccional que desempeña un papel importante en la defensa del huésped mediante la regulación de las respuestas inmunitarias e inflamatorias. La IL-6 es producida por linfocitos T, monocitos, fibroblastos, células endoteliales y queratinocitos, y posee múltiples funciones biológicas. Puede promover la diferenciación de linfocitos B y la producción de anticuerpos; sinérgicamente, la IL-3 participa en el desarrollo de megacariocitos y la producción de plaquetas, induce la expresión de proteínas de fase aguda en el hígado y regula el metabolismo óseo. La IL-6 transmite señales a través del sistema receptor de IL-6, compuesto por dos cadenas: IL-6Rα y gp130. STAT3 es la molécula decisiva para mantener el estado indiferenciado de las células madre embrionarias, mientras que la IL-6 es el promotor inicial de la vía de señalización JAK/STAT3.

Ligando LFLT3 (FL)
El ligando FLT3 es un factor de crecimiento que regula la expansión temprana de células hematopoyéticas. Se une a las células que expresan el receptor de tirosina quinasa FLT3. El ligando FLT3 por sí mismo no estimula la expansión de células hematopoyéticas tempranas, sino que induce sinérgicamente el crecimiento y la diferenciación con otros CSF e interleucinas. A diferencia del SCF, el ligando FLT3 no tiene efecto sobre los mastocitos. Se han identificado múltiples subtipos de ligando FLT3. La principal forma bioactiva se ancla en la superficie celular como el dominio extracelular de la proteína transmembrana (209a). El isómero unido a la membrana puede ser escindido por proteínas para generar isómeros solubles biológicamente activos.

FMS-Regaliz chino 3
La tirosina quinasa 3 similar a FMS (FL3), altamente expresada en células CD34+CD38dim, transmite señales a la célula uniéndose a sus receptores activos de tirosina quinasa (TKR) específicos. FL3 actúa sobre las HSC/HPC y ejerce regulación hematopoyética uniéndose a los TKR en la superficie celular. FL3 también es un factor estimulante de células progenitoras tempranas muy importante, con un efecto promotor significativo en la expansión in vitro de HSC/HPC. Puede impedir que las células madre CD34+ se diferencien gradualmente y agoten las HPC durante la expansión in vitro.

Factor de crecimiento transformante-β
Los subtipos del factor de crecimiento transformante β, el factor de crecimiento transformante β 1, β 2 y β 3 de mamíferos emiten señales a través del mismo receptor, lo que provoca respuestas biológicas similares. Son citocinas multifuncionales que regulan la expansión, el crecimiento, la diferenciación y el movimiento celular, así como la síntesis y el depósito de la matriz extracelular. El factor de crecimiento transformante β (TGF-β) es producido por las células estromales de la médula ósea. Inhibe la entrada de las células madre hematopoyéticas (HSC)/células hematopoyéticas (HPC) tempranas en la fase S, lo que provoca que la mayoría de las HSC/HPC se encuentren en la fase G0.

Proteína inflamatoria de macrófagos-1 α
La proteína inflamatoria de macrófagos-1β (MIP-1β) es un antagonista natural de la MIP-1α, que puede estar presente en su cuerpo. Puede mitigar el efecto inhibidor de la MIP-1α sobre las células madre hematopoyéticas (CMH)/células hematopoyéticas (CPH) tempranas e impedir que las CMH recuperen su estado latente.

P38
P38, una molécula de señalización perteneciente a la familia de las proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK), inhibe la expansión in vitro de las HSC en condiciones de normoxia. Experimentos han demostrado que, al añadir HSC a medios de cultivo sin suero que contienen TPO, SCF y FL3, el estrés oxidativo activa p38 y p16, lo que provoca una disminución significativa del número de HSC murinas.

Factor estimulante de colonias de granulomacrofagos (GM-CSF)
El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos es un fármaco utilizado clínicamente para diversas causas de leucopenia o granulocitopenia. El agente de movilización celular actual es el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), que no solo aumenta el número de células madre hematopoyéticas en sangre periférica, sino que también contribuye a la función cardíaca y otras funciones.

Factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF)
Los efectos de los factores estimulantes de colonias de granulocitos generalmente incluyen la presentación de antígenos, la mejora de la función macrófaga y la promoción de la expansión de células madre hematopoyéticas. El factor estimulante de colonias de granulocitos es un potente agente de movilización de células madre de la médula ósea, que puede estimular la expansión de células madre autólogas de la médula ósea y movilizarlas desde la médula ósea hacia la sangre periférica.

Eritropoyetina (EPO)
La eritropoyetina (EPO) es el principal factor estimulante de la diferenciación hematopoyética, que puede promover la diferenciación de células madre hematopoyéticas en glóbulos rojos primitivos, acelerar la división y expansión de glóbulos rojos jóvenes, promover la síntesis de hemoglobina y también desempeñar un papel importante en el estudio de la diferenciación inducida por glóbulos rojos.
Las células madre hematopoyéticas tienen el potencial de autorrenovación y diferenciación multidireccional. La combinación de diferentes factores tiene distintos efectos en su expansión. El uso de células madre hematopoyéticas puede inducir selectivamente la producción de múltiples células, lo que sin duda ofrece nuevas ideas para la expansión de las células NK. Actualmente, las células NK pueden inducirse a partir de células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas (iPSC), pero tanto las células madre embrionarias como las células madre pluripotentes inducidas deben transformarse en células madre hematopoyéticas antes de que puedan diferenciarse en células NK. Por lo tanto, las células madre hematopoyéticas desempeñan un papel fundamental en este proceso. Las ventajas de las células NK derivadas de células madre son su capacidad de uso a demanda, su alta homogeneidad, su baja liberación de citocinas y su alta actividad citotóxica. Por lo tanto, existe un gran interés en explorar las células NK derivadas de células madre en el mercado. Existe literatura sobre la inducción de células madre a células NK. Nos centramos principalmente en los factores mencionados en la literatura.

1. Células NK derivadas de células madre embrionarias humanas

Las células madre hematopoyéticas se transfirieron a cocultivo con la línea celular estromal de médula ósea murina M210-B4 en un medio que contenía RPMI 1640, 15 % de suero fetal bovino definido, 2 mM de L-glutamina, 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % de penicilina/estreptomiocina y 0,1 mM de -mercaptoetanol, con cambios de medio cada 2 o 3 días, como se describió previamente. Después de 17 a 20 días, se preparó una suspensión de células individuales y se aislaron las células CD34+CD45+, como se describió previamente. Las células aisladas se transfirieron a un segundo cocultivo con la línea celular estromal derivada de hígado fetal murino AFT024 en un medio que contenía una mezcla 1:2 de medio Eagle modificado por Dulbecco/Ham F12, 20 % de AB de suero humano inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina, 1 % de penicilina/estreptomiocina, 5 ng/ml de selenito de sodio, 50 μM de etanolamina, 25 μM de -mercaptoetanol, 20 mg/mL de ácido ascórbico, interleucina-3, factor de células madre, IL-15 , ligando de tirosina quinasa 3 similar a Fms e IL-7 . Las células se alimentaron con medio fresco mediante cambios de medio cada 5 a 6 días. Después de 30 a 35 días en cultivo, se cosecharon las células, se filtraron a través de un filtro de 70 μm y se usaron para análisis posteriores.

2. Células NK derivadas de células madre pluripotentes humanas

Se recolectaron células de 18 a 21 días para el enriquecimiento de células progenitoras CD34+ CD45+. Se colocaron cien mil células CD34+ CD45+ en el estroma de EL08-1D2 con 1 ml de citocinas iniciadoras de células NK (IL-3, IL-7, IL-15, factor de células madre y ligando del receptor de tirosina quinasa tipo fms-3). Los cultivos de células NK se renovaron con 0,5 ml de medio con citocinas cada 4 a 5 días. Las células NK maduras se midieron a los 28-35 días de cultivo en EL08-1D2.

Citocinas y factores de crecimiento relacionados con células madre T&L

Acerca de T&L
T&L Biotechnology Ltd., fundada en 2011, se centra en la investigación y el desarrollo de materias primas y reactivos de grado GMP para terapia celular y génica (TCG). Nos comprometemos a ofrecer productos y servicios confiables para las ciencias de la vida.