Résumé des facteurs protéiques impliqués dans la culture de cellules souches hématopoïétiques

Source : T&L Biotechnology Date de publication : 2023-07-13

Introduction
Au cours des dernières années, Cellules souchesLes cellules souches sont de plus en plus utilisées en clinique. Cependant, la proportion et la quantité de cellules souches dans le corps humain sont extrêmement faibles, ce qui ne permet pas de répondre aux besoins cliniques. Par conséquent, l'expansion et la culture in vitro de cellules souches ont pris une importance croissante. Pour des raisons éthiques et technologiques, le traitement des cellules souches reste confronté à de nombreux problèmes. Les marqueurs de surface des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques et des différentes lignées de cellules sanguines sont relativement clairs. Les caractéristiques phénotypiques des cellules peuvent être sélectionnées et séparées quantitativement, et leurs fonctions sont relativement libres, sans nécessiter de processus complexes en aval tels que des « échafaudages biologiques » pour les transplantations nerveuses, vasculaires et chirurgicales. Il s'agit donc du modèle idéal pour l'expansion et la différenciation des cellules souches, et il est également pratique pour une utilisation clinique directe.
Les cellules souches hématopoïétiques présentent un haut degré d'auto-renouvellement et de multiples potentiels de différenciation. Elles peuvent produire toutes les cellules sanguines matures, telles que les globules rouges, les globules blancs, les plaquettes et les lymphocytes, et reconstruire l'ensemble du système hématopoïétique. L'expansion in vitro de cellules souches hématopoïétiques nécessite de maintenir leur capacité d'auto-renouvellement tout en empêchant leur différenciation, ce qui en fait une technologie très complexe. Ces dernières années, de nombreuses expériences ont montré que la différenciation des cellules souches hématopoïétiques dépend des cytokines. Nous résumerons brièvement les facteurs et leurs effets utilisés en culture de cellules souches hématopoïétiques.

Facteur de cellules souches (SCF)
Le facteur de cellules souches (SCF) est un facteur qui agit en ancrant et en exprimant le récepteur tyrosine c-Kit à la surface de toutes les cellules souches hématopoïétiques (CSH). Une expression défectueuse de c-Kit entraîne une diminution du nombre de CSH en expansion. Actuellement, presque toutes les combinaisons de cytokines utilisées dans les expériences de culture de CSH contiennent du SCF. De plus, SCF et FL3 appartiennent à la famille des récepteurs tyrosine kinase TKR, qui exercent un effet synergique sur l'expansion des cellules hématopoïétiques primitives. En se liant à un TKR spécifique, le SCF transmet des signaux aux cellules, initiant ainsi la division et l'expansion précoces des cellules progénitrices, permettant ainsi aux cellules de commencer leur expansion et inhibant l'apoptose après la fin de la phase G0.

Thrombopoïétine（Tpo）
On pensait initialement que la TPO était un facteur de croissance spécifique des mégacaryocytes, appartenant à la catégorie des cytokines à action spécifique capables de maintenir l'expansion, la différenciation, la maturation, la division et la formation de plaquettes fonctionnelles dans les mégacaryocytes. C'est le facteur privilégié pour l'expansion des mégacaryocytes. Ces dernières années, des expériences ont confirmé que la TPO joue un rôle important dans la promotion de l'expansion des CSH in vitro. Associée à d'autres cytokines, elle peut augmenter le nombre total d'unités formant colonie et le taux d'expansion des cellules souches CD34+. En particulier dans les combinaisons FL3, elle peut maintenir la croissance et l'expansion à long terme des cellules souches CD34+ du sang de cordon.

Interleukine-3 (IL-3)
Interleukine-3 (IL-3), également connue sous le nom de maslymphocyte T Le facteur de croissance est une cytokine pléiotrope principalement produite par les lymphocytes T activés, capable de stimuler la prolifération et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques pluripotentes et des cellules progénitrices de différentes lignées. Après l'hétérodimérisation induite par l'IL-3 des récepteurs de surface des cellules souches, ces derniers peuvent se lier à de nombreuses protéines de transduction du signal, telles que la voie JAK/STAT (Janus kinase signal transducer and transcriptional activator), stimulant ainsi un flux de signal régulé à la baisse et participant à la régulation de l'expansion des cellules souches. L'IL-3 peut également activer la voie ERK (extracellular signal regulated kinase) et la voie JNK (c-jun aminotransférase), induisant ainsi la croissance, l'expansion et la survie des cellules souches.

Interleukine-6 ​​(IL-6)
L'IL-6 est une cytokine multidirectionnelle qui joue un rôle important dans la défense de l'hôte en régulant les réponses immunitaires et inflammatoires. Produite par les lymphocytes T, les monocytes, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les kératinocytes, l'IL-6 possède de multiples fonctions biologiques. Elle favorise la différenciation des lymphocytes B et la production d'anticorps. De manière synergique, l'IL-3 joue un rôle dans le développement des mégacaryocytes et la production de plaquettes, induit l'expression de protéines de phase aiguë dans le foie et régule le métabolisme osseux. L'IL-6 transmet des signaux via son système récepteur, composé de deux chaînes : IL-6Rα et gp130. STAT3 est la molécule essentielle au maintien de l'état indifférencié des cellules souches embryonnaires, tandis que l'IL-6 est le promoteur initial de la voie de signalisation JAK/STAT3.

Ligand LFLT3 (FL)
Le ligand FLT3 est un facteur de croissance qui régule l'expansion précoce des cellules hématopoïétiques. Il se lie aux cellules exprimant le récepteur tyrosine kinase FLT3. Le ligand FLT3 lui-même ne stimule pas l'expansion des cellules hématopoïétiques précoces, mais induit plutôt en synergie la croissance et la différenciation avec d'autres LCR et interleukines. Contrairement au SCF, le ligand FLT3 n'a aucun effet sur les mastocytes. Plusieurs sous-types de ligand FLT3 ont été identifiés. La principale forme bioactive est ancrée à la surface cellulaire comme domaine extracellulaire d'une protéine transmembranaire (209a). L'isomère lié à la membrane peut être clivé par des protéines pour générer des isomères solubles biologiquement actifs.

FMS-Réglisse chinoise 3
La tyrosine kinase 3 (FL3), de type FMS, fortement exprimée dans les cellules CD34+CD38dim, transmet des signaux à la cellule en se liant à ses récepteurs tyrosine kinases actifs (TKR) spécifiques. FL3 agit sur les CSH/CPH et exerce une régulation hématopoïétique en se liant aux TKR à la surface cellulaire. FL3 est également un facteur de stimulation des cellules progénitrices précoces très important, qui favorise significativement l'expansion in vitro des CSH/CPH. Il peut empêcher les cellules souches CD34+ de se différencier progressivement et de dépléter les CPH lors de l'expansion in vitro.

Facteur de croissance transformant-β
Les sous-types de facteurs de croissance transformants β, β1, β2 et β3 des mammifères émettent des signaux via le même récepteur, provoquant des réponses biologiques similaires. Ce sont des cytokines multifonctionnelles qui régulent l'expansion, la croissance, la différenciation et le mouvement cellulaires, ainsi que la synthèse et le dépôt de matrice extracellulaire. Le facteur de croissance transformant β (TGF-β) est produit par les cellules stromales de la moelle osseuse. Il empêche les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et les cellules souches hématopoïétiques (CSH) précoces d'entrer en phase S, ce qui place la plupart des CSH/CSH en phase G0.

Protéine inflammatoire des macrophages-1 α
La protéine inflammatoire des macrophages 1β (MIP-1β) est un antagoniste naturel de MIP-1α, qui peut être associé à cette protéine. Elle peut atténuer l'effet inhibiteur de MIP-1α sur les CSH/CPH précoces et empêcher le retour des CSH à un état de quiescence.

P38
La protéine p38, une molécule de signalisation appartenant à la famille des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK), inhibe l'expansion in vitro des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en conditions normoxiques. Des expériences ont montré que lorsque des CSH sont ajoutées à des milieux de culture sans sérum contenant de la TPO, du SCF et du FL3, le stress oxydatif active les protéines p38 et p16, entraînant une diminution significative du nombre de CSH murines.

Facteur de stimulation des colonies de granulomacrophages (GM-CSF)
Le facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages (GM-CSF) est un médicament utilisé en clinique pour traiter diverses causes de leucopénie ou de granulocytopénie. L'agent de mobilisation cellulaire actuel est le GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor), qui non seulement augmente le nombre de cellules souches hématopoïétiques dans le sang périphérique, mais contribue également à la fonction cardiaque et à d'autres fonctions.

Facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF)
Les effets des facteurs de stimulation des colonies de granulocytes comprennent généralement la présentation d'antigènes, l'amélioration de la fonction des macrophages et la promotion de l'expansion des cellules souches hématopoïétiques. Le facteur de stimulation des colonies de granulocytes est un puissant agent de mobilisation des cellules souches de la moelle osseuse, capable de stimuler l'expansion des cellules souches autologues de la moelle osseuse et de les mobiliser de la moelle osseuse vers le sang périphérique.

Érythropoïétine (EPO)
L'érythropoïétine (EPO) est le principal facteur stimulant de la différenciation hématopoïétique, qui peut favoriser la différenciation des cellules souches hématopoïétiques en globules rouges primitifs, accélérer la division et l'expansion des jeunes globules rouges, favoriser la synthèse de l'hémoglobine et également jouer un rôle important dans l'étude de la différenciation induite par les globules rouges.
Les cellules souches hématopoïétiques ont le potentiel de s'auto-renouveler et de se différencier multidirectionnellement. La combinaison de différents facteurs a des effets différents sur leur multiplication. L'utilisation de cellules souches hématopoïétiques peut induire sélectivement la production de multiples cellules, ce qui ouvre sans aucun doute de nouvelles perspectives pour la multiplication des cellules NK. Actuellement, les cellules NK peuvent être induites à partir de cellules souches embryonnaires et de cellules souches pluripotentes induites (CSPi), mais ces dernières et les cellules souches pluripotentes induites doivent être transformées en cellules souches hématopoïétiques avant de pouvoir se différencier en cellules NK. Les cellules souches hématopoïétiques jouent donc un rôle essentiel dans ce processus. Les avantages des cellules NK dérivées de cellules souches résident dans leur utilisation à la demande, leur forte homogénéité, leur faible libération de cytokines et leur forte activité létale. Par conséquent, l'exploration des cellules NK dérivées de cellules souches sur le marché suscite toujours un vif intérêt. Il existe des publications sur l'induction de cellules souches en cellules NK. Nous nous concentrons principalement sur les facteurs mentionnés dans ces publications.

1. Cellules NK dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) ont été transférées en coculture avec la lignée cellulaire stromale de moelle osseuse murine M210-B4 dans un milieu contenant du RPMI 1640, 15 % de sérum fœtal bovin défini, 2 mM de L-glutamine, 1 % d'acides aminés non essentiels, 1 % de pénicilline/streptomyocine et 0,1 mM de -mercaptoéthanol, le milieu étant changé tous les 2 à 3 jours, comme décrit précédemment. Après 17 à 20 jours, une suspension cellulaire unique a été préparée et les cellules CD34+CD45+ ont été isolées, comme décrit précédemment. Français Les cellules isolées ont été transférées dans une seconde coculture avec la lignée cellulaire stromale dérivée du foie fœtal murin AFT024 dans un milieu contenant un mélange 1:2 de milieu Eagle modifié par Dulbecco/Ham F12, 20 % de sérum humain AB inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomyocine, 5 ng/mL de sélénite de sodium, 50 μM d'éthanolamine, 25 μM de -mercaptoéthanol, 20 mg/mL d'acide ascorbique, d'interleukine-3, de facteur de cellules souches, d'IL-15, de ligand de la tyrosine kinase 3 de type Fms et d'IL-7. Les cellules ont été nourries avec du milieu frais en changeant de moitié le milieu tous les 5 à 6 jours. Après 30 à 35 jours de culture, les cellules ont été récoltées, filtrées sur un filtre de 70 μm et utilisées pour des analyses plus approfondies.

2. Cellules NK dérivées de cellules souches pluripotentes humaines

Nous avons récolté des cellules âgées de 18 à 21 jours pour l'enrichissement en cellules progénitrices CD34+ CD45+. Cent mille cellules CD34+ CD45+ ont été placées sur le stroma EL08-1D2 avec 1 ml de cytokines initiatrices de cellules NK (IL-3, IL-7, IL-15, facteur de cellules souches et ligand du récepteur tyrosine kinase de type fms-3). Les cultures de cellules NK ont été renouvelées avec 0,5 ml de milieu contenant des cytokines tous les 4 à 5 jours. Les cellules NK matures ont été mesurées à 28-35 jours de culture sur EL08-1D2.

Cytokines et facteurs de croissance liés aux cellules souches T&L

À propos de T&L
Fondée en 2011, T&L Biotechnology Ltd. se concentre sur la recherche et le développement de matières premières et de réactifs de qualité BPF en amont pour la thérapie cellulaire et génique (TCG). Nous nous engageons à fournir des produits et services fiables pour les sciences de la vie.