हेमाटोपोइएटिक स्टेम सेल कल्चर में शामिल प्रोटीन कारकों का सारांश

स्रोत: टी एंड एल बायोटेक्नोलॉजी रिलीज का समय: 2023-07-13

परिचय
हाल के वर्षों में, मूल कोशिकानैदानिक ​​अनुप्रयोगों में स्टेम कोशिकाओं का उपयोग तेजी से व्यापक रूप से किया जाने लगा है। हालांकि, मानव शरीर में स्टेम कोशिकाओं का अनुपात और मात्रा बेहद कम है, जो नैदानिक ​​आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर सकती है। इसलिए, स्टेम कोशिकाओं का इन विट्रो विस्तार और संवर्धन तेजी से महत्वपूर्ण हो गया है। नैतिक और तकनीकी कारणों से, स्टेम कोशिकाओं के उपचार में अभी भी कई समस्याएं हैं। हेमटोपोइएटिक स्टेम/प्रोजेनिटर कोशिकाओं और रक्त कोशिकाओं की विभिन्न वंशावली के सतही मार्कर अपेक्षाकृत स्पष्ट हैं, और कोशिकाओं की फेनोटाइपिक विशेषताओं को मात्रात्मक रूप से चुना जा सकता है, अलग किया जा सकता है, और उनके कार्य अपेक्षाकृत स्वतंत्र हो सकते हैं, तंत्रिका, संवहनी और शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण के लिए "जैविक मचान" जैसी जटिल डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं की आवश्यकता के बिना। इसलिए, यह स्टेम सेल विस्तार और भेदभाव के लिए सबसे अच्छा मॉडल है, और प्रत्यक्ष नैदानिक ​​उपयोग के लिए भी सुविधाजनक है।
हेमाटोपोइएटिक स्टेम सेल में स्व-नवीनीकरण और कई विभेदन क्षमताएँ उच्च स्तर की होती हैं। वे सभी परिपक्व रक्त कोशिकाओं, जैसे कि लाल रक्त कोशिकाओं, श्वेत रक्त कोशिकाओं, प्लेटलेट्स और लिम्फोसाइट्स का उत्पादन कर सकते हैं, और पूरे हेमाटोपोइएटिक सिस्टम का पुनर्निर्माण कर सकते हैं। हेमाटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार के लिए उनकी स्व-नवीनीकरण क्षमता को बनाए रखना आवश्यक है, साथ ही उनके विभेदन को रोकना भी आवश्यक है, जिससे यह एक अत्यधिक चुनौतीपूर्ण तकनीक बन जाती है। हाल के वर्षों में, बड़ी संख्या में प्रयोगों से पता चला है कि हेमाटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं का विभेदन साइटोकिन्स पर निर्भर करता है। हम हेमाटोपोइएटिक स्टेम सेल संस्कृति में उपयोग किए जाने वाले कारकों और उनके प्रभावों का संक्षेप में सारांश देंगे।

स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ)
स्टेम सेल फैक्टर (SCF) एक ऐसा फैक्टर है जो सभी HSC की सतह पर टायरोसिन रिसेप्टर c-Kit को एंकरिंग और एक्सप्रेस करके काम करता है। दोषपूर्ण c-Kit अभिव्यक्ति HSC विस्तार की संख्या में कमी की ओर ले जाती है। वर्तमान में, HSC संस्कृति प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले लगभग सभी साइटोकाइन संयोजनों में SCF होता है। इसके अलावा, SCF और FL3 दोनों ही टायरोसिन किनेज रिसेप्टर TKR परिवार से संबंधित हैं, जिसका आदिम हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के विस्तार पर एक सहक्रियात्मक प्रभाव होता है। विशिष्ट TKR से बंध कर, SCF कोशिकाओं को संकेत प्रेषित करता है, प्रारंभिक विभाजन और प्रोजेनिटर कोशिकाओं के विस्तार की शुरुआत करता है, जिससे कोशिकाओं को G0 चरण पूरा करने के बाद विस्तार करना और एपोप्टोसिस को रोकना शुरू करने की अनुमति मिलती है।

थ्रोम्बोपोइटिन（टीपीओ）
टीपीओ को शुरू में मेगाकारियोसाइट्स के लिए एक विशिष्ट वृद्धि कारक माना जाता था, जो विशिष्ट अभिनय साइटोकिन्स की श्रेणी से संबंधित है जो मेगाकारियोसाइट्स में कार्यात्मक प्लेटलेट्स के विस्तार, भेदभाव, परिपक्वता, विभाजन और गठन को बनाए रख सकता है। यह मेगाकारियोसाइट्स के विस्तार के लिए पसंदीदा कारक है। हाल के वर्षों में, प्रयोगों ने पुष्टि की है कि टीपीओ इन विट्रो अध्ययनों में एचएससी विस्तार को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और जब अन्य साइटोकिन्स के साथ संयुक्त होता है, तो यह कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की कुल संख्या और सीडी 34 + स्टेम कोशिकाओं के विस्तार गुना को बढ़ा सकता है। विशेष रूप से FL3 संयोजनों में, यह गर्भनाल रक्त CD34 + स्टेम कोशिकाओं के दीर्घकालिक विकास और विस्तार को बनाए रख सकता है।

इंटरल्यूकिन-3 (IL-3)
इंटरल्यूकिन-3 (IL-3), जिसे मास के नाम से भी जाना जाता हैटी कोशिका ग्रोथ फैक्टर, एक प्लियोट्रोपिक साइटोकाइन है जो मुख्य रूप से सक्रिय टी लिम्फोसाइट्स द्वारा निर्मित होता है, जो प्लुरिपोटेंट एचएससी और विभिन्न वंश उन्मुख पूर्वज कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव को उत्तेजित कर सकता है। स्टेम सेल सतह रिसेप्टर्स के IL-3 प्रेरित हेटेरोडाइमराइजेशन के बाद, वे कई सिग्नल ट्रांसडक्शन प्रोटीन से बंध सकते हैं, जैसे कि जेनस किनेज सिग्नलिंग ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर (JAK/STAT) मार्ग, जिससे डाउनरेगुलेटेड सिग्नल फ्लो उत्तेजित होता है और स्टेम सेल विस्तार के विनियमन में भाग लेता है। IL-3 स्टेम सेल के विकास, विस्तार और अस्तित्व को प्रेरित करते हुए एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल रेगुलेटेड किनेज (ERK) मार्ग और c-jun एमिनोट्रांस्फरेज (JNK) मार्ग को भी सक्रिय कर सकता है।

इंटरल्यूकिन-6 (IL-6)
IL-6 एक बहुआयामी साइटोकाइन है जो प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को विनियमित करके मेजबान रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। IL-6 टी कोशिकाओं, मोनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और केराटिनोसाइट्स द्वारा निर्मित होता है, और इसके कई जैविक कार्य होते हैं। यह बी सेल भेदभाव और एंटीबॉडी उत्पादन को बढ़ावा दे सकता है, सहक्रियात्मक रूप से IL-3 मेगाकारियोसाइट्स और प्लेटलेट उत्पादन के विकास में भूमिका निभाता है, यकृत में तीव्र चरण प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, और हड्डी के चयापचय को विनियमित करता है। IL-6 IL-6 रिसेप्टर सिस्टम के माध्यम से संकेतों को प्रसारित करता है, जो दो श्रृंखलाओं से बना होता है: IL-6Rα और gp130। STAT3 भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की अविभेदित स्थिति को बनाए रखने में निर्णायक अणु है, जबकि IL-6 JAK/STAT3 सिग्नलिंग मार्ग का प्रारंभिक प्रमोटर है।

एलएफएलटी3 लिगैंड (एफएल)
FLT3 लिगैंड एक वृद्धि कारक है जो प्रारंभिक हेमटोपोइएटिक कोशिका विस्तार को नियंत्रित करता है। FLT3 लिगैंड टायरोसिन किनेज रिसेप्टर FLT3 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं से जुड़ता है। FLT3 लिगैंड स्वयं प्रारंभिक हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के विस्तार को उत्तेजित नहीं करता है, बल्कि अन्य CSF और इंटरल्यूकिन के साथ सहक्रियात्मक रूप से वृद्धि और भेदभाव को प्रेरित करता है। SCF के विपरीत, FLT3 लिगैंड का मस्तूल कोशिकाओं पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। FLT3 लिगैंड के कई उपप्रकारों की पहचान की गई है। मुख्य बायोएक्टिव रूप कोशिका की सतह पर ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन (209a.) के बाह्यकोशिकीय डोमेन के रूप में लंगर डाला जाता है। झिल्ली से बंधे आइसोमर को प्रोटीन द्वारा जैविक रूप से सक्रिय घुलनशील आइसोमरों को उत्पन्न करने के लिए विभाजित किया जा सकता है।

एफएमएस-चीनी मुलेठी 3
CD34+CD38dim कोशिकाओं में अत्यधिक अभिव्यक्त FMS-liketyrosine kinease 3 (FL3) कोशिका को उसके विशिष्ट tyrosine kinase सक्रिय रिसेप्टर्स (TKRs) से बंधकर संकेतों को प्रेषित करता है। FL3 HSC/HPC पर कार्य करता है और कोशिका की सतह पर TKR से बंधकर हेमटोपोइएटिक विनियमन करता है। FL3 एक बहुत ही महत्वपूर्ण प्रारंभिक प्रोजेनिटर सेल उत्तेजक कारक भी है, जिसका HSC/HPC के इन विट्रो विस्तार पर महत्वपूर्ण बढ़ावा देने वाला प्रभाव होता है। यह CD34+ स्टेम कोशिकाओं को इन विट्रो विस्तार के दौरान धीरे-धीरे विभेदित होने और HPC को कम करने से रोक सकता है।

परिवर्तनकारी वृद्धि कारक- β
ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर- β, ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर- β 1 β 2 और β 3 स्तनधारियों के उपप्रकार एक ही रिसेप्टर के माध्यम से संकेत उत्सर्जित करते हैं, जिससे समान जैविक प्रतिक्रियाएं होती हैं। वे बहुक्रियाशील साइटोकिन्स हैं जो कोशिका विस्तार, वृद्धि, विभेदन और गति को नियंत्रित करते हैं, साथ ही साथ बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के संश्लेषण और जमाव को भी नियंत्रित करते हैं। ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर- β (TGF- β) अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा निर्मित होता है। यह प्रारंभिक HSC/HPC को S चरण में प्रवेश करने से रोकता है, जिससे अधिकांश HSC/HPC G0 चरण में होते हैं।

मैक्रोफेज इन्फ्लेमेटरी प्रोटीन-1 α
मैक्रोफेज इन्फ्लेमेटरी प्रोटीन-1β (MIP-1β) MIP-1α का एक प्राकृतिक विरोधी है, जो इसके साथ होता है। यह प्रारंभिक HSC/HPC पर MIP-1α के निरोधात्मक प्रभाव को कम कर सकता है और HSC को निष्क्रिय अवस्था में लौटने से रोक सकता है।

पी38
माइटोजेन एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेज (MAPK) परिवार से संबंधित सिग्नलिंग अणु के रूप में P38, नॉर्मोक्सिक स्थितियों के तहत HSCs के इन विट्रो विस्तार को रोकता है। प्रयोगों से पता चला है कि जब HSCs को TPO, SCF और FL3 युक्त सीरम-मुक्त कल्चर मीडिया में मिलाया जाता है, तो ऑक्सीडेटिव तनाव p38 और p16 को सक्रिय करता है, जिससे माउस HSCs की संख्या में उल्लेखनीय कमी आती है।

ग्रैनुलोमैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ)
ग्रैनुलोसाइट मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक एक दवा है जिसका उपयोग ल्यूकोपेनिया या ग्रैनुलोसाइटोपेनिया के विभिन्न कारणों के लिए चिकित्सकीय रूप से किया जाता है। वर्तमान सेल मोबिलाइज़ेशन एजेंट ग्रैनुलोसाइट मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) है, जो न केवल परिधीय रक्त में हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं की संख्या बढ़ाता है, बल्कि हृदय समारोह और अन्य कार्यों में भी सहायता करता है।

ग्रैन्यूलोसाइट कॉलोनी उत्तेजक कारक (जी-सीएसएफ)
ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारकों के प्रभावों में आम तौर पर एंटीजन प्रस्तुति, मैक्रोफेज फ़ंक्शन की वृद्धि और हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल विस्तार को बढ़ावा देना शामिल है। ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं के लिए एक शक्तिशाली गतिशीलता एजेंट है, जो ऑटोलॉगस अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं के विस्तार को उत्तेजित कर सकता है और उन्हें अस्थि मज्जा से परिधीय रक्त में गतिशील कर सकता है।

एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ)
एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ) हेमाटोपोइएटिक विभेदन में मुख्य उत्तेजक कारक है, जो हेमाटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के आदिम लाल रक्त कोशिकाओं में विभेदन को बढ़ावा दे सकता है, युवा लाल रक्त कोशिकाओं के विभाजन और विस्तार में तेजी ला सकता है, हीमोग्लोबिन के संश्लेषण को बढ़ावा दे सकता है, और लाल रक्त कोशिका प्रेरित विभेदन के अध्ययन में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।
हेमाटोपोइएटिक स्टेम सेल में स्व-नवीकरण और बहु-दिशात्मक विभेदन की क्षमता होती है। विभिन्न कारकों के संयोजन से हेमाटोपोइएटिक स्टेम सेल के विस्तार पर अलग-अलग प्रभाव पड़ते हैं। हेमाटोपोइएटिक स्टेम सेल का उपयोग चुनिंदा रूप से कई कोशिकाओं के उत्पादन को प्रेरित कर सकता है, जो निस्संदेह NK कोशिकाओं के विस्तार के लिए नए विचार प्रदान करता है। वर्तमान में, NK कोशिकाओं को भ्रूण स्टेम सेल और iPSC से प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन भ्रूण स्टेम सेल और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल दोनों को NK कोशिकाओं में विभेदित करने से पहले हेमाटोपोइएटिक स्टेम सेल में बदलने की आवश्यकता होती है। इसलिए, हेमाटोपोइएटिक स्टेम सेल इस प्रक्रिया में एक अपरिहार्य पुल की भूमिका निभाते हैं। स्टेम सेल से प्राप्त NK कोशिकाओं के लाभ यह हैं कि उनका उपयोग मांग पर किया जा सकता है, उनमें मजबूत समरूपता, कम साइटोकाइन रिलीज और मजबूत मारक गतिविधि होती है। इसलिए, बाजार में स्टेम सेल से प्राप्त NK कोशिकाओं की खोज के लिए अभी भी उच्च उत्साह है। NK कोशिकाओं में स्टेम सेल के प्रेरण पर साहित्य हैं। हम मुख्य रूप से साहित्य में उल्लिखित कारकों पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

1. मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त एनके कोशिकाएं

HESCs को RPMI 1640, 15% परिभाषित भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 mM L-ग्लूटामाइन, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमायोसिन और 0.1 mM-मर्कैप्टोएथेनॉल युक्त माध्यम में म्यूरिन बोन मैरो स्ट्रोमल सेल लाइन M210-B4 के साथ सहसंस्कृति में स्थानांतरित किया गया था, जिसमें पहले वर्णित अनुसार हर 2 से 3 दिन में माध्यम परिवर्तन किया गया था। 17 से 20 दिनों के बाद, एकल-कोशिका निलंबन तैयार किया गया और CD34+CD45+ कोशिकाओं को अलग किया गया, जैसा कि पहले वर्णित किया गया था। पृथक कोशिकाओं को मूषक भ्रूण यकृत-व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिका रेखा AFT024 के साथ दूसरे सहसंस्कृति में एक 1:2 मिश्रण वाले माध्यम में स्थानांतरित किया गया जिसमें डल्बेको संशोधित ईगल माध्यम/हैम F12, 20% ताप-निष्क्रिय मानव सीरम AB, 2 mM L-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमायोसिन, 5 ng/mL सोडियम सेलेनाइट, 50μM इथेनॉलमाइन, 25μM -मर्कैप्टोइथेनॉल, 20 mg/mL एस्कॉर्बिक एसिड, इंटरल्यूकिन-3, स्टेम सेल फैक्टर, IL-15, Fms-लाइक टायरोसिन किनेज 3 लिगैंड और IL-7 शामिल थे। कोशिकाओं को हर 5 से 6 दिन में आधा माध्यम बदलकर ताजा माध्यम खिलाया गया।

2. मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त एनके कोशिकाएं

हमने CD34+ CD45+ प्रोजेनिटर सेल संवर्धन के लिए 18-21 दिन की कोशिकाओं को काटा। एक लाख CD34+ CD45+ कोशिकाओं को EL08-1D2 स्ट्रोमा पर 1 मिली NK सेल आरंभिक साइटोकाइन्स (IL-3, IL7, IL-15, स्टेम सेल फैक्टर, और fms-जैसे टायरोसिन किनेज रिसेप्टर-3 लिगैंड) के साथ रखा। NK सेल कल्चर को हमने हर 4-5 दिन में 0.5 मिली साइटोकाइन युक्त माध्यम से ताज़ा किया। EL08-1D2 पर कल्चर के 28-35 दिनों में परिपक्व NK कोशिकाओं को मापा गया।

टी एंड एल स्टेम सेल संबंधित साइटोकाइन्स और वृद्धि कारक

टी एंड एल के बारे में
2011 में स्थापित टीएंडएल बायोटेक्नोलॉजी लिमिटेड, सेल और जीन थेरेपी (सीजीटी) के अपस्ट्रीम जीएमपी ग्रेड कच्चे माल और अभिकर्मकों के अनुसंधान और विकास पर ध्यान केंद्रित करता है। हम जीवन विज्ञान के लिए विश्वसनीय उत्पाद और सेवाएँ प्रदान करने के लिए प्रतिबद्ध हैं