Riepilogo dei fattori proteici coinvolti nella coltura delle cellule staminali emopoietiche

Fonte: T&L Biotechnology Data di pubblicazione: 13/07/2023

Introduzione
Negli ultimi anni, Cellula staminaleLe cellule staminali sono state sempre più utilizzate nelle applicazioni cliniche. Tuttavia, la proporzione e la quantità di cellule staminali nel corpo umano sono estremamente basse, il che non consente di soddisfare le esigenze cliniche. Pertanto, l'espansione e la coltivazione in vitro delle cellule staminali sono diventate sempre più importanti. Per ragioni etiche e tecnologiche, il trattamento delle cellule staminali presenta ancora numerosi problemi. I marcatori di superficie delle cellule staminali/progenitrici emopoietiche e di vari lignaggi di cellule del sangue sono relativamente chiari, e le caratteristiche fenotipiche delle cellule possono essere selezionate quantitativamente, separate e le loro funzioni possono essere relativamente libere, senza la necessità di complessi processi a valle come "scaffold biologici" per il trapianto nervoso, vascolare e chirurgico. Pertanto, rappresenta il modello migliore per l'espansione e la differenziazione delle cellule staminali, ed è anche conveniente per l'uso clinico diretto.
Le cellule staminali emopoietiche presentano un elevato grado di auto-rinnovamento e molteplici potenziali di differenziazione. Possono produrre tutte le cellule del sangue mature, come globuli rossi, globuli bianchi, piastrine e linfociti, e possono ricostruire l'intero sistema emopoietico. L'espansione in vitro delle cellule staminali emopoietiche richiede il mantenimento della loro capacità di auto-rinnovamento, prevenendone al contempo la differenziazione, il che la rende una tecnologia estremamente complessa. Negli ultimi anni, numerosi esperimenti hanno dimostrato che la differenziazione delle cellule staminali emopoietiche dipende dalle citochine. Riassumiamo brevemente i fattori e i loro effetti utilizzati nella coltura di cellule staminali emopoietiche.

Fattore delle cellule staminali (SCF)
Il fattore delle cellule staminali (SCF) è un fattore che agisce ancorando ed esprimendo il recettore della tirosina c-Kit sulla superficie di tutte le cellule staminali ematopoietiche (HSC). Un'espressione difettosa di c-Kit porta a una riduzione del numero di espansioni di HSC. Attualmente, quasi tutte le combinazioni di citochine utilizzate negli esperimenti di coltura di HSC contengono SCF. Inoltre, sia SCF che FL3 appartengono alla famiglia dei recettori tirosin-chinasici TKR, che ha un effetto sinergico sull'espansione delle cellule ematopoietiche primitive. Legandosi a specifici TKR, SCF trasmette segnali alle cellule, avviando la divisione e l'espansione precoci delle cellule progenitrici, consentendo alle cellule di iniziare l'espansione e inibendo l'apoptosi dopo aver completato la fase G0.

Trombopoietina（Tpo）
Inizialmente si riteneva che la TPO fosse un fattore di crescita specifico per i megacariociti, appartenente alla categoria delle citochine ad azione specifica in grado di mantenere l'espansione, la differenziazione, la maturazione, la divisione e la formazione di piastrine funzionali nei megacariociti. È il fattore preferito per l'espansione dei megacariociti. Negli ultimi anni, gli esperimenti hanno confermato che la TPO svolge un ruolo importante nel promuovere l'espansione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) in studi in vitro e, in combinazione con altre citochine, può aumentare il numero totale di unità formanti colonie e la piega di espansione delle cellule staminali CD34+. Soprattutto nelle combinazioni FL3, può mantenere la crescita e l'espansione a lungo termine delle cellule staminali CD34+ del sangue del cordone ombelicale.

Interleuchina-3 (IL-3)
Interleuchina-3 (IL-3), nota anche come masCellula T Il fattore di crescita IL-3 è una citochina pleiotropica prodotta principalmente dai linfociti T attivati, in grado di stimolare la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche pluripotenti (HSC) e delle cellule progenitrici orientate a diversi ceppi. Dopo l'eterodimerizzazione dei recettori di superficie delle cellule staminali indotta da IL-3, questi possono legarsi a numerose proteine ​​di trasduzione del segnale, come la via del trasduttore di segnalazione e attivatore trascrizionale della Janus chinasi (JAK/STAT), stimolando così un flusso di segnali downregolato e partecipando alla regolazione dell'espansione delle cellule staminali. IL-3 può anche attivare la via della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) e la via della c-jun aminotransferasi (JNK), inducendo la crescita, l'espansione e la sopravvivenza delle cellule staminali.

Interleuchina-6 (IL-6)
L'IL-6 è una citochina multidirezionale che svolge un ruolo importante nella difesa dell'ospite regolando le risposte immunitarie e infiammatorie. L'IL-6 è prodotta da linfociti T, monociti, fibroblasti, cellule endoteliali e cheratinociti e ha molteplici funzioni biologiche. Può promuovere la differenziazione dei linfociti B e la produzione di anticorpi, in sinergia con l'IL-3 svolge un ruolo nello sviluppo dei megacariociti e nella produzione di piastrine, induce l'espressione delle proteine ​​di fase acuta nel fegato e regola il metabolismo osseo. L'IL-6 trasmette segnali attraverso il sistema recettoriale dell'IL-6, composto da due catene: IL-6Rα e gp130. STAT3 è la molecola decisiva nel mantenimento dello stato indifferenziato delle cellule staminali embrionali, mentre l'IL-6 è il promotore iniziale della via di segnalazione JAK/STAT3.

Ligandio LFLT3 (FL)
Il ligando FLT3 è un fattore di crescita che regola l'espansione precoce delle cellule emopoietiche. Il ligando FLT3 si lega alle cellule che esprimono il recettore tirosin-chinasi FLT3. Il ligando FLT3 di per sé non stimola l'espansione delle cellule emopoietiche precoci, ma induce sinergicamente la crescita e la differenziazione con altri LCR e interleuchine. A differenza del SCF, il ligando FLT3 non ha effetto sui mastociti. Sono stati identificati diversi sottotipi del ligando FLT3. La principale forma bioattiva è ancorata alla superficie cellulare come dominio extracellulare della proteina transmembrana (209a). L'isomero legato alla membrana può essere scisso dalle proteine ​​per generare isomeri solubili biologicamente attivi.

FMS-Liquirizia cinese 3
La tirosina chinasi 3 (FL3) FMS-like, altamente espressa nelle cellule CD34+CD38dim, trasmette segnali alla cellula legandosi ai suoi specifici recettori tirosin-chinasici attivi (TKR). FL3 agisce sulle cellule staminali ematopoietiche (HSC/HPC) ed esercita una regolazione emopoietica legandosi al TKR sulla superficie cellulare. FL3 è anche un importantissimo fattore stimolante le cellule progenitrici precoci, che ha un significativo effetto promotore sull'espansione in vitro di HSC/HPC. Può impedire alle cellule staminali CD34+ di differenziarsi gradualmente e di esaurire le cellule staminali ematopoietiche (HPC) durante l'espansione in vitro.

Fattore di crescita trasformante-β
I sottotipi di fattore di crescita trasformante-β, fattore di crescita trasformante-β1, fattore di crescita trasformante-β2 e fattore di crescita trasformante-β3 dei mammiferi emettono segnali attraverso lo stesso recettore, causando risposte biologiche simili. Sono citochine multifunzionali che regolano l'espansione, la crescita, la differenziazione e il movimento cellulare, nonché la sintesi e la deposizione della matrice extracellulare. Il fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) è prodotto dalle cellule stromali del midollo osseo. Inibisce l'ingresso delle cellule staminali ematopoietiche (HSC/HPC) precoci nella fase S, causando il passaggio della maggior parte delle HSC/HPC alla fase G0.

Proteina infiammatoria dei macrofagi-1 α
La proteina infiammatoria dei macrofagi-1β (MIP-1β) è un antagonista naturale della MIP-1α, a cui si associa. Può attenuare l'effetto inibitorio della MIP-1α sulle cellule staminali ematopoietiche (HSC/HPC) in fase iniziale e impedire che le cellule staminali ematopoietiche (HSC) tornino a uno stato quiescente.

Pagina 38
P38, in quanto molecola di segnalazione appartenente alla famiglia delle proteine ​​chinasi attivate da mitogeni (MAPK), inibisce l'espansione in vitro delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) in condizioni normossiche. Esperimenti hanno dimostrato che quando le HSC vengono aggiunte a terreni di coltura privi di siero contenenti TPO, SCF e FL3, lo stress ossidativo attiva p38 e p16, portando a una significativa riduzione del numero di HSC murine.

Fattore stimolante le colonie di granulomacrofagi (GM-CSF)
Il fattore stimolante le colonie di granulociti e macrofagi è un farmaco utilizzato clinicamente per varie cause di leucopenia o granulocitopenia. L'agente di mobilizzazione cellulare attualmente utilizzato è il fattore stimolante le colonie di granulociti e macrofagi (GM-CSF), che non solo aumenta il numero di cellule staminali emopoietiche nel sangue periferico, ma contribuisce anche alla funzionalità cardiaca e ad altre funzioni.

Fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF)
Gli effetti dei fattori stimolanti le colonie di granulociti includono generalmente la presentazione dell'antigene, il miglioramento della funzionalità dei macrofagi e la promozione dell'espansione delle cellule staminali emopoietiche. Il fattore stimolante le colonie di granulociti è un potente agente di mobilizzazione delle cellule staminali del midollo osseo, in grado di stimolare l'espansione delle cellule staminali autologhe del midollo osseo e di mobilizzarle dal midollo osseo al sangue periferico.

Eritropoietina (EPO)
L'eritropoietina (EPO) è il principale fattore stimolante nella differenziazione emopoietica, che può promuovere la differenziazione delle cellule staminali emopoietiche in globuli rossi primitivi, accelerare la divisione e l'espansione dei globuli rossi giovani, promuovere la sintesi dell'emoglobina e svolgere anche un ruolo importante nello studio della differenziazione indotta dai globuli rossi.
Le cellule staminali emopoietiche hanno il potenziale per l'auto-rinnovamento e la differenziazione multidirezionale. La combinazione di diversi fattori ha effetti diversi sull'espansione delle cellule staminali emopoietiche. L'uso di cellule staminali emopoietiche può indurre selettivamente la produzione di cellule multiple, il che offre senza dubbio nuove idee per l'espansione delle cellule NK. Attualmente, le cellule NK possono essere indotte da cellule staminali embrionali e iPSC, ma sia le cellule staminali embrionali che le cellule staminali pluripotenti indotte devono essere trasformate in cellule staminali emopoietiche prima di poter differenziare in cellule NK. Pertanto, le cellule staminali emopoietiche svolgono un ruolo fondamentale in questo processo. I vantaggi delle cellule NK derivate da cellule staminali sono la possibilità di essere utilizzate su richiesta, l'elevata omogeneità, il basso rilascio di citochine e la forte attività di killing. Pertanto, c'è ancora un grande entusiasmo per l'esplorazione delle cellule NK derivate da cellule staminali presenti sul mercato. Esistono pubblicazioni sull'induzione di cellule staminali in cellule NK. Ci concentriamo principalmente sui fattori menzionati in letteratura.

1. Cellule NK derivate da cellule staminali embrionali umane

Le HESC sono state trasferite in cocoltura con la linea cellulare stromale di midollo osseo murino M210-B4 in un terreno di coltura contenente RPMI 1640, siero fetale bovino definito al 15%, L-glutammina 2 mM, aminoacidi non essenziali all'1%, penicillina/streptomiocina all'1% e mercaptoetanolo 0,1 mM, con cambi del terreno di coltura ogni 2-3 giorni, come precedentemente descritto. Dopo 17-20 giorni, è stata preparata una sospensione cellulare singola e sono state isolate cellule CD34+CD45+, come precedentemente descritto. Le cellule isolate sono state trasferite in una seconda cocoltura con la linea cellulare stromale derivata da fegato fetale murino AFT024 in un terreno contenente una miscela 1:2 di terreno Eagle modificato Dulbecco/Ham F12, 20% siero umano inattivato termicamente AB, 2 mM L-glutammina, 1% penicillina/streptomiocina, 5 ng/mL selenito di sodio, 50 μM etanolamina, 25 μM -mercaptoetanolo, 20 mg/mL acido ascorbico, interleuchina-3, fattore delle cellule staminali, IL-15, ligando della tirosina chinasi 3 tipo Fms e IL-7. Le cellule sono state alimentate con terreno fresco sostituendone metà del terreno ogni 5-6 giorni. Dopo 30-35 giorni di coltura, le cellule sono state raccolte, filtrate attraverso un filtro da 70 μm e utilizzate per ulteriori analisi.

2. Cellule NK derivate da cellule staminali pluripotenti umane

Abbiamo raccolto cellule di 18-21 giorni per l'arricchimento di cellule progenitrici CD34+ CD45+. Centomila cellule CD34+ CD45+ sono state posizionate sullo stroma di EL08-1D2 con 1 ml di citochine che stimolano la produzione di cellule NK (IL-3, IL-7, IL-15, fattore delle cellule staminali e ligando del recettore tirosin-chinasi fms-like-3). Le colture di cellule NK sono state rinnovate con 0,5 ml di terreno di coltura contenente citochine ogni 4-5 giorni. Le cellule NK mature sono state misurate a 28-35 giorni di coltura su EL08-1D2.

Citochine e fattori di crescita correlati alle cellule staminali T&L

Informazioni su T&L
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