조혈모세포 배양에 관여하는 단백질 인자 요약

출처: T&L Biotechnology 출시일: 2023-07-13

소개
최근 몇 년 동안, 줄기세포줄기세포는 임상 응용 분야에서 점점 더 널리 사용되고 있습니다. 그러나 인체 내 줄기세포의 비율과 양은 매우 적어 임상적 요구를 충족할 수 없습니다. 따라서 줄기세포의 체외 증식 및 배양이 점점 더 중요해지고 있습니다. 윤리적, 기술적 이유로 줄기세포 치료는 여전히 많은 문제에 직면해 있습니다. 조혈줄기/전구세포와 다양한 혈액세포 계통의 표면 마커는 비교적 명확하며, 세포의 표현형적 특성을 정량적으로 선별 및 분리할 수 있고, 신경, 혈관 및 외과적 이식을 위한 "생물학적 스캐폴드"와 같은 복잡한 후속 공정 없이도 기능을 비교적 자유롭게 수행할 수 있습니다. 따라서 줄기세포 증식 및 분화를 위한 최적의 모델이며, 직접적인 임상 적용에도 편리합니다.
조혈줄기세포는 높은 자가복제 능력과 다분화 능력을 가지고 있습니다. 적혈구, 백혈구, 혈소판, 림프구 등 모든 성숙한 혈액 세포를 생산할 수 있으며, 조혈계 전체를 재건할 수 있습니다. 조혈줄기세포의 체외 배양은 자가복제 능력을 유지하는 동시에 분화를 억제해야 하므로 매우 어려운 기술입니다. 최근 많은 실험을 통해 조혈줄기세포의 분화가 사이토카인에 의존한다는 것이 밝혀졌습니다. 조혈줄기세포 배양에 사용되는 요인과 그 효과를 간략하게 요약해 보겠습니다.

줄기세포인자(SCF)
줄기세포 인자(SCF)는 모든 조혈모세포(HSC) 표면에 티로신 수용체 c-Kit를 고정하고 발현시키는 인자입니다. c-Kit 발현 결함은 HSC 증식 횟수 감소로 이어집니다. 현재 HSC 배양 실험에 사용되는 거의 모든 사이토카인 조합에는 SCF가 포함되어 있습니다. 또한, SCF와 FL3는 모두 티로신 키나제 수용체 TKR 계열에 속하며, 이는 원시 조혈모세포 증식에 ​​시너지 효과를 나타냅니다. SCF는 특정 TKR에 결합하여 세포에 신호를 전달하고, 전구세포의 초기 분열과 증식을 촉진하여 세포 증식을 시작하고 G0기 완료 후 세포자멸사를 억제합니다.

트롬보포이에틴（티포）
TPO는 처음에는 거핵세포의 특이적 성장인자로 여겨졌으며, 거핵세포에서 기능성 혈소판의 확장, 분화, 성숙, 분열 및 형성을 유지할 수 있는 특이적 작용 사이토카인 범주에 속합니다. TPO는 거핵세포 확장에 선호되는 인자입니다. 최근 몇 년 동안의 실험을 통해 TPO가 체외 연구에서 조혈모세포(HSC) 확장을 촉진하는 데 중요한 역할을 하며, 다른 사이토카인과 병용 시 CD34+ 줄기세포의 총 콜로니 형성 단위 수와 확장 배수를 증가시킬 수 있음이 확인되었습니다. 특히 FL3와 병용 시 제대혈 CD34+ 줄기세포의 장기적인 성장과 확장을 유지할 수 있습니다.

인터루킨-3(IL-3)
인터루킨-3(IL-3)은 mas로도 알려져 있습니다.T 세포 성장 인자는 활성화된 T 림프구에서 주로 생성되는 다면발현성 사이토카인으로, 다능성 조혈모세포(HSC)와 다양한 계통의 전구세포의 증식과 분화를 자극할 수 있습니다. IL-3는 줄기세포 표면 수용체의 이종이량체화를 유도한 후, JAK/STAT(Janus kinase signaling transducer and transcriptional activator) 경로와 같은 다양한 신호전달 단백질에 결합하여 하향조절된 신호 흐름을 자극하고 줄기세포 증식 조절에 관여합니다. IL-3는 또한 세포외 신호조절 키나아제(ERK) 경로와 C-jun 아미노전이효소(JNK) 경로를 활성화시켜 줄기세포의 성장, 증식, 그리고 생존을 유도할 수 있습니다.

인터루킨-6(IL-6)
IL-6는 면역 및 염증 반응을 조절하여 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 다방향성 사이토카인입니다. IL-6는 T 세포, 단핵구, 섬유아세포, 내피세포, 각질세포에서 생성되며 다양한 생물학적 기능을 합니다. B 세포 분화 및 항체 생성을 촉진하고, 거핵구 발달 및 혈소판 생성에 시너지 효과를 발휘하며, 간에서 급성기 단백질 발현을 유도하고 골 대사를 조절합니다. IL-6는 IL-6Rα와 gp130의 두 사슬로 구성된 IL-6 수용체 시스템을 통해 신호를 전달합니다. STAT3는 배아줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 데 결정적인 역할을 하는 분자이며, IL-6는 JAK/STAT3 신호전달 경로의 초기 프로모터입니다.

LFLT3 리간드(FL)
FLT3 리간드는 초기 조혈세포 증식을 조절하는 성장인자입니다. FLT3 리간드는 티로신 키나아제 수용체 FLT3를 발현하는 세포에 결합합니다. FLT3 리간드 자체는 초기 조혈세포의 증식을 자극하지 않지만, 다른 뇌척수액(CSF) 및 인터루킨과 함께 시너지 효과를 발휘하여 성장 및 분화를 유도합니다. SCF와 달리 FLT3 리간드는 비만세포에 영향을 미치지 않습니다. FLT3 리간드의 여러 아형이 확인되었습니다. 주요 생리활성 형태는 막관통단백질(209a)의 세포외 도메인으로 세포 표면에 고정되어 있습니다. 막에 결합된 이성질체는 단백질에 의해 절단되어 생물학적으로 활성인 가용성 이성질체를 생성할 수 있습니다.

FMS-중국산 감초 3
CD34+CD38dim 세포에서 고도로 발현되는 FMS-유사 티로신 키네아제 3(FL3)은 특정 티로신 키네아제 활성 수용체(TKR)에 결합하여 세포에 신호를 전달합니다. FL3은 HSC/HPC에 작용하여 세포 표면의 TKR에 결합하여 조혈 조절을 합니다. 또한 FL3은 매우 중요한 초기 전구세포 자극인자로, HSC/HPC의 시험관 내 증식에 유의미한 촉진 효과를 나타냅니다. FL3은 시험관 내 증식 과정에서 CD34+ 줄기세포가 점진적으로 분화하여 HPC를 고갈시키는 것을 방지할 수 있습니다.

성장인자-β
포유류의 형질전환성장인자-β, 형질전환성장인자-β1, β2, β3 아형은 동일한 수용체를 통해 신호를 방출하여 유사한 생물학적 반응을 유발합니다. 이들은 세포 확장, 성장, 분화, 이동뿐만 아니라 세포외기질의 합성 및 침착을 조절하는 다기능 사이토카인입니다. 형질전환성장인자-β(TGF-β)는 골수 기질 세포에서 생성됩니다. 초기 HSC/HPC가 S기로 진입하는 것을 억제하여 대부분의 HSC/HPC가 G0기로 이동하게 합니다.

대식세포 염증 단백질-1α
대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β)는 MIP-1α의 천연 길항제이며, MIP-1α와 함께 작용할 수 있습니다. MIP-1β는 초기 HSC/HPC에 대한 MIP-1α의 억제 효과를 완화하고 HSC가 휴면 상태로 돌아가는 것을 방지할 수 있습니다.

P38
미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 계열에 속하는 신호전달 분자인 P38은 정상 산소 조건에서 HSC의 시험관 내 증식을 억제합니다. 실험 결과, TPO, SCF, FL3가 포함된 무혈청 배양 배지에 HSC를 첨가했을 때 산화 스트레스가 p38과 p16을 활성화시켜 마우스 HSC의 수가 현저히 감소하는 것으로 나타났습니다.

과립대식세포 집락자극인자(GM-CSF)
과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 백혈구 감소증이나 과립구 감소증의 다양한 원인에 임상적으로 사용되는 약물입니다. 현재 세포 동원제는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)로, 말초 혈액 내 조혈모세포 수를 증가시킬 뿐만 아니라 심장 기능 및 기타 기능에도 도움을 줍니다.

과립구 집락 자극 인자(G-CSF)
과립구 콜로니 자극 인자(GCCSF)의 효과는 일반적으로 항원 제시, 대식세포 기능 향상, 그리고 조혈모세포 증식 촉진을 포함합니다. 과립구 콜로니 자극 인자는 골수 줄기세포의 강력한 동원 인자로, 자가 골수 줄기세포의 증식을 자극하여 골수에서 말초혈액으로 이동시킬 수 있습니다.

에리스로포이에틴(EPO)
에리스로포이에틴(EPO)은 조혈 분화의 주요 자극인자로, 조혈줄기세포의 원시적혈구로의 분화를 촉진하고, 젊은 적혈구의 분열과 확장을 가속화하며, 헤모글로빈 합성을 촉진하고, 적혈구 유도 분화 연구에도 중요한 역할을 합니다.
조혈줄기세포는 자가복제 및 다방향 분화의 잠재력을 가지고 있습니다. 다양한 요인의 조합은 조혈줄기세포의 증식에 각기 다른 영향을 미칩니다. 조혈줄기세포를 사용하면 여러 세포의 생성을 선택적으로 유도할 수 있으며, 이는 NK 세포 증식에 ​​대한 새로운 아이디어를 제공합니다. 현재 NK 세포는 배아줄기세포와 iPSC에서 유도될 수 있지만, 배아줄기세포와 유도만능줄기세포 모두 NK 세포로 분화되기 전에 조혈줄기세포로 전환되어야 합니다. 따라서 조혈줄기세포는 이 과정에서 필수적인 가교 역할을 합니다. 줄기세포 유래 NK 세포의 장점은 필요에 따라 사용할 수 있고, 균질성이 높으며, 사이토카인 방출이 적고, 살상 활성이 강하다는 것입니다. 따라서 줄기세포 유래 NK 세포에 대한 연구는 여전히 활발히 진행되고 있습니다. 줄기세포를 NK 세포로 유도하는 방법에 대한 문헌들이 있지만, 본 연구에서는 주로 문헌에 언급된 요인들에 초점을 맞추고 있습니다.

1. 인간 배아줄기세포에서 유래한 NK세포

HESC를 마우스 골수 기질 세포주 M210-B4와 RPMI 1640, 15% 소태아혈청(DFSB), 2 mM L-글루타민, 1% 비필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토미오신, 그리고 0.1 mM β-머캅토에탄올을 함유하는 배지에서 공동 배양하였으며, 이전에 기술된 바와 같이 2~3일마다 배지를 교체하였다. 17~20일 후, 단일 세포 현탁액을 제조하고 이전에 기술된 바와 같이 CD34+CD45+ 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 Dulbecco 변형 Eagle 배지/Ham F12, 20% 열 불활성화 인간 혈청 AB, 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토미오신, 5 ng/mL 셀레나이트나트륨, 50μM 에탄올아민, 25μM -머캅토에탄올, 20 mg/mL 아스코르브산, 인터루킨-3, 줄기 세포 인자, IL-15, Fms 유사 티로신 키나제 3 리간드 및 IL-7의 1:2 혼합물이 포함된 배지에서 마우스 태아 간 유래 간질 세포주 AFT024와 함께 2차 공동 배양으로 옮겼습니다. 세포는 5~6일마다 배지를 절반씩 갈아주면서 새로운 배지를 공급받았습니다. 배양한 지 30~35일 후 세포를 수확하여 70μm 필터로 여과하고 추가 분석에 사용했습니다.

2. 인간 다능성 줄기세포에서 유래한 NK세포

CD34+ CD45+ 전구세포 농축을 위해 18~21일 배양한 세포를 채취했습니다. 10만 개의 CD34+ CD45+ 세포를 EL08-1D2 기질에 NK 세포 개시 사이토카인(IL-3, IL-7, IL-15, 줄기세포 인자, FMS 유사 티로신 키나아제 수용체-3 리간드) 1ml와 함께 배치했습니다. NK 세포 배양액은 4~5일마다 사이토카인이 함유된 배지 0.5ml로 교체했습니다. 성숙 NK 세포는 EL08-1D2에서 배양 28~35일째에 측정했습니다.

T&L 줄기세포 관련 사이토카인 및 성장 인자

T&L 소개
2011년에 설립된 T&L Biotechnology Ltd.는 세포 및 유전자 치료(CGT)의 상류 GMP 등급 원료 및 시약 연구 개발에 집중하고 있습니다. 생명 과학 분야에서 신뢰할 수 있는 제품과 서비스를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다.