Rezumatul factorilor proteici implicați în cultura celulelor stem hematopoietice

Sursă: T&L Biotechnology Data lansării: 13.07.2023

Introducere
În ultimii ani, Celule stemCelulele stem au devenit din ce în ce mai utilizate pe scară largă în aplicațiile clinice. Cu toate acestea, proporția și cantitatea de celule stem din corpul uman sunt extrem de scăzute, ceea ce nu poate satisface nevoile clinice. Prin urmare, extinderea in vitro și cultivarea celulelor stem au devenit din ce în ce mai importante. Din motive etice și tehnologice, tratamentul celulelor stem se confruntă încă cu multe probleme. Markerii de suprafață ai celulelor stem/progenitoare hematopoietice și ai diferitelor linii de celule sanguine sunt relativ clari, iar caracteristicile fenotipice ale celulelor pot fi selectate cantitativ, separate, iar funcțiile lor pot fi relativ libere, fără a fi nevoie de procese complexe în aval, cum ar fi „schele biologice” pentru transplantul nervos, vascular și chirurgical. Prin urmare, este cel mai bun model pentru extinderea și diferențierea celulelor stem și este, de asemenea, convenabil pentru utilizarea clinică directă.
Celulele stem hematopoietice au un grad ridicat de autoreînnoire și potențiale multiple de diferențiere. Acestea pot produce toate celulele sanguine mature, cum ar fi globulele roșii, leucocitele, trombocitele și limfocitele, și pot reconstrui întregul sistem hematopoietic. Extinderea in vitro a celulelor stem hematopoietice necesită menținerea capacității lor de autoreînnoire, prevenind în același timp diferențierea lor, ceea ce o face o tehnologie extrem de dificilă. În ultimii ani, un număr mare de experimente au arătat că diferențierea celulelor stem hematopoietice depinde de citokine. Vom rezuma pe scurt factorii și efectele acestora utilizați în cultura celulelor stem hematopoietice.

Factorul celulelor stem (SCF)
Factorul celular stem (SCF) este un factor care acționează prin ancorarea și exprimarea receptorului de tirozină c-Kit pe suprafața tuturor HSC-urilor. Expresia defectuoasă a c-Kit duce la o scădere a numărului de expansiuni HSC. În prezent, aproape toate combinațiile de citokine utilizate în experimentele de cultură HSC conțin SCF. În plus, atât SCF, cât și FL3 aparțin familiei receptorilor de tirozin kinază TKR, care are un efect sinergic asupra expansiunii celulelor hematopoietice primitive. Prin legarea la TKR specifici, SCF transmite semnale către celule, inițiind diviziunea timpurie și expansiunea celulelor progenitoare, permițând celulelor să înceapă să se extindă și inhibând apoptoza după finalizarea fazei G0.

Trombopoietină (Tpo）
Inițial, s-a crezut că TPO este un factor de creștere specific pentru megacariocite, aparținând categoriei de citokine cu acțiune specifică, care pot menține expansiunea, diferențierea, maturarea, diviziunea și formarea trombocitelor funcționale în megacariocite. Este factorul preferat pentru extinderea megacariocitelor. În ultimii ani, experimentele au confirmat că TPO joacă un rol important în promovarea expansiunii HSC în studiile in vitro și, atunci când este combinată cu alte citokine, poate crește numărul total de unități formatoare de colonii și rata de expansiune a celulelor stem CD34+. În special în combinațiile FL3, poate menține creșterea și extinderea pe termen lung a celulelor stem CD34+ din sângele cordonului ombilical.

Interleukina-3 (IL-3)
Interleukina-3 (IL-3), cunoscută și sub denumirea de masCelulă T Factorul de creștere este o citokină pleiotropică produsă în principal de limfocitele T activate, care poate stimula proliferarea și diferențierea HSC-urilor pluripotente și a diferitelor celule progenitoare orientate spre linie. După heterodimerizarea receptorilor de suprafață a celulelor stem indusă de IL-3, aceștia se pot lega de numeroase proteine ​​de transducție a semnalului, cum ar fi calea traductorului de semnalizare și activatorului transcripțional Janus kinazei (JAK/STAT), stimulând astfel un flux de semnal reglat negativ și participând la reglarea expansiunii celulelor stem. IL-3 poate activa, de asemenea, calea kinazei reglate de semnalul extracelular (ERK) și calea c-jun aminotransferază (JNK), inducând creșterea, expansiunea și supraviețuirea celulelor stem.

Interleukina-6 (IL-6)
IL-6 este o citokină multidirecțională care joacă un rol important în apărarea gazdei prin reglarea răspunsurilor imune și inflamatorii. IL-6 este produsă de celulele T, monocite, fibroblaste, celule endoteliale și keratinocite și are multiple funcții biologice. Poate promova diferențierea celulelor B și producția de anticorpi, IL-3 joacă sinergic un rol în dezvoltarea megacariocitelor și producția de trombocite, induce expresia proteinelor de fază acută în ficat și reglează metabolismul osos. IL-6 transmite semnale prin sistemul receptorilor IL-6, care este compus din două lanțuri: IL-6Rα și gp130. STAT3 este molecula decisivă în menținerea stării nediferențiate a celulelor stem embrionare, în timp ce IL-6 este promotorul inițial al căii de semnalizare JAK/STAT3.

Ligand LFLT3 (FL)
Ligandul FLT3 este un factor de creștere care reglează expansiunea timpurie a celulelor hematopoietice. Ligandul FLT3 se leagă de celulele care exprimă receptorul tirozin kinazei FLT3. Ligandul FLT3 în sine nu stimulează expansiunea celulelor hematopoietice timpurii, ci mai degrabă induce sinergic creșterea și diferențierea cu alte LCR și interleukine. Spre deosebire de SCF, ligandul FLT3 nu are niciun efect asupra mastocitelor. Au fost identificate mai multe subtipuri de ligand FLT3. Principala formă bioactivă este ancorată pe suprafața celulară ca domeniu extracelular al proteinei transmembranare (209a.). Izomerul legat de membrană poate fi scindat de proteine ​​pentru a genera izomeri solubili biologic activi.

FMS-Lemn dulce chinezesc 3
Tirozin kinaza 3 (FL3), de tip FMS, exprimată la nivel înalt în celulele CD34+CD38dim, transmite semnale către celulă prin legarea la receptorii săi activi specifici pentru tirozin kinază (TKR). FL3 acționează asupra HSC/HPC și exercită reglarea hematopoietică prin legarea la TKR de pe suprafața celulei. FL3 este, de asemenea, un factor de stimulare a celulelor progenitoare timpurii foarte important, care are un efect promotor semnificativ asupra expansiunii in vitro a HSC/HPC. Poate împiedica diferențierea treptată și epuizarea HPC de către celulele stem CD34+ în timpul expansiunii in vitro.

Factorul de creștere transformant - β
Factorul de creștere transformant - β, subtipurile de mamifere ale factorului de creștere transformant - β1, β2 și β3 emit semnale prin același receptor, provocând răspunsuri biologice similare. Acestea sunt citokine multifuncționale care reglează expansiunea, creșterea, diferențierea și mișcarea celulară, precum și sinteza și depunerea matricei extracelulare. Factorul de creștere transformant - β (TGF-β) este produs de celulele stromale din măduva osoasă. Acesta inhibă intrarea HSC/HPC timpurii în faza S, determinând ca majoritatea HSC/HPC să fie în faza G0.

Proteina inflamatorie a macrofagelor-1 α
Proteina inflamatorie a macrofagelor-1β (MIP-1β) este un antagonist natural al MIP-1α, care poate fi însoțit de aceasta. Poate ameliora efectul inhibitor al MIP-1α asupra HSC/HPC incipiente și poate preveni revenirea HSC la o stare latentă.

P38
P38, ca moleculă de semnalizare aparținând familiei de proteine ​​kinaze activate de mitogen (MAPK), inhibă expansiunea in vitro a HSC-urilor în condiții normoxice. Experimentele au arătat că atunci când HSC-urile sunt adăugate în medii de cultură fără ser care conțin TPO, SCF și FL3, stresul oxidativ activează p38 și p16, ducând la o scădere semnificativă a numărului de HSC-uri de șoarece.

Factorul de stimulare a coloniilor de granulomacrofage (GM-CSF)
Factorul de stimulare a coloniilor de granulocite și macrofage este un medicament utilizat clinic pentru diverse cauze de leucopenie sau granulocitopenie. Agentul actual de mobilizare celulară este factorul de stimulare a coloniilor de granulocite și macrofage (GM-CSF), care nu numai că crește numărul de celule stem hematopoietice din sângele periferic, dar ajută și la funcția cardiacă și la alte funcții.

Factorul de stimulare a coloniilor de granulocite (G-CSF)
Efectele factorilor de stimulare a coloniilor de granulocite includ, în general, prezentarea antigenului, creșterea funcției macrofagelor și promovarea expansiunii celulelor stem hematopoietice. Factorul de stimulare a coloniilor de granulocite este un agent puternic de mobilizare pentru celulele stem din măduva osoasă, care poate stimula expansiunea celulelor stem autologe din măduva osoasă și le poate mobiliza din măduva osoasă în sângele periferic.

Eritropoietină (EPO)
Eritropoietina (EPO) este principalul factor stimulator în diferențierea hematopoietică, care poate promova diferențierea celulelor stem hematopoietice în globule roșii primitive, poate accelera diviziunea și expansiunea globulelor roșii tinere, poate promova sinteza hemoglobinei și, de asemenea, poate juca un rol important în studiul diferențierii induse de globule roșii.
Celulele stem hematopoietice au potențialul de autoreînnoire și diferențiere multidirecțională. Combinarea diferiților factori are efecte diferite asupra expansiunii celulelor stem hematopoietice. Utilizarea celulelor stem hematopoietice poate induce selectiv producerea de celule multiple, ceea ce oferă, fără îndoială, noi idei pentru expansiunea celulelor NK. În prezent, celulele NK pot fi induse din celule stem embrionare și iPSC-uri, dar atât celulele stem embrionare, cât și celulele stem pluripotente induse trebuie transformate în celule stem hematopoietice înainte de a se putea diferenția în celule NK. Prin urmare, celulele stem hematopoietice joacă un rol indispensabil în acest proces. Avantajele celulelor NK derivate din celule stem sunt că pot fi utilizate la cerere, au o omogenitate puternică, eliberare scăzută de citokine și activitate puternică de ucidere. Prin urmare, există încă un mare entuziasm pentru explorarea celulelor NK derivate din celule stem pe piață. Există literatură despre inducerea celulelor stem în celule NK. Ne concentrăm în principal pe factorii menționați în literatura de specialitate.

1. Celule NK derivate din celule stem embrionare umane

Celulele stem HESC au fost transferate în cocultură cu linia celulară stromală de măduvă osoasă murină M210-B4 într-un mediu conținând RPMI 1640, 15% ser fetal bovin definit, 2 mM L-glutamină, 1% aminoacizi neesențiali, 1% penicilină/streptomiocină și 0,1 mM -mercaptoetanol, cu schimbarea mediului la fiecare 2 până la 3 zile, așa cum s-a descris anterior. După 17 până la 20 de zile, s-a preparat o suspensie de celule individuale și s-au izolat celulele CD34+CD45+, așa cum s-a descris anterior. Celulele izolate au fost transferate într-o a doua cocultură cu linia celulară stromală derivată din ficat fetal murin AFT024 într-un mediu conținând un amestec 1:2 de mediu Eagle modificat Dulbecco/Ham F12, 20% ser uman AB inactivat termic, 2 mM L-glutamină, 1% penicilină/streptomiocină, 5 ng/mL selenit de sodiu, 50 μM etanolamină, 25 μM -mercaptoetanol, 20 mg/mL acid ascorbic, interleukină-3, factor de celule stem, IL-15, ligand tirozin kinaza 3 de tip Fms și IL-7. Celulele au fost hrănite cu mediu proaspăt, schimbând jumătate din mediu la fiecare 5 până la 6 zile. După 30 până la 35 de zile de cultură, celulele au fost recoltate, filtrate printr-un filtru de 70 μm și utilizate pentru analize ulterioare.

2. Celule NK derivate din celule stem pluripotente umane

Am recoltat celule la 18-21 de zile pentru îmbogățirea cu celule progenitoare CD34+ CD45+. O sută de mii de celule CD34+ CD45+ au fost plasate pe stroma EL08-1D2 cu 1 ml de citokine inițiatorie a celulelor NK (IL-3, IL7, IL-15, factor de celule stem și ligand al receptorului-3 al tirozin kinazei de tip fms). Culturile de celule NK au fost reîmprospătate cu 0,5 ml de mediu conținând citokine la fiecare 4-5 zile. Celulele NK mature au fost măsurate la 28-35 de zile de cultură pe EL08-1D2.

Citokine și factori de creștere legați de celulele stem T&L

Despre T&L
T&L Biotechnology Ltd., fondată în 2011, se concentrează pe cercetarea și dezvoltarea de materii prime și reactivi de calitate GMP pentru terapia celulară și genică (CGT). Ne angajăm să furnizăm produse și servicii fiabile pentru știința vieții.