Përmbledhje e Faktorëve të Proteinave të Përfshirë në Kulturën e Qelizave Staminale Hematopoietike

Burimi: T&L Biotechnology Koha e publikimit: 2023-07-13

Hyrje
Në vitet e fundit, Qeliza staminalejanë përdorur gjithnjë e më gjerësisht në aplikimet klinike. Megjithatë, përqindja dhe sasia e qelizave staminale në trupin e njeriut janë jashtëzakonisht të ulëta, gjë që nuk mund të përmbushë nevojat klinike. Prandaj, zgjerimi dhe kultivimi in vitro i qelizave staminale janë bërë gjithnjë e më të rëndësishme. Për shkak të arsyeve etike dhe teknologjike, trajtimi i qelizave staminale ende përballet me shumë probleme. Shënuesit sipërfaqësorë të qelizave staminale/progjenitore hematopoietike dhe linjave të ndryshme të qelizave të gjakut janë relativisht të qarta, dhe karakteristikat fenotipike të qelizave mund të zgjidhen në mënyrë sasiore, të ndahen dhe funksionet e tyre mund të jenë relativisht të lira, pa nevojën për procese komplekse pasuese siç janë "skelat biologjike" për transplantimin nervor, vaskular dhe kirurgjikal. Prandaj, është modeli më i mirë për zgjerimin dhe diferencimin e qelizave staminale, dhe është gjithashtu i përshtatshëm për përdorim të drejtpërdrejtë klinik.
Qelizat staminale hematopoietike kanë një shkallë të lartë të vetëripërtëritjes dhe potenciale të diferencimit të shumëfishtë. Ato mund të prodhojnë të gjitha qelizat e pjekura të gjakut, siç janë qelizat e kuqe të gjakut, qelizat e bardha të gjakut, trombocitet dhe limfocitet, dhe mund të rindërtojnë të gjithë sistemin hematopoietik. Zgjerimi in vitro i qelizave staminale hematopoietike kërkon ruajtjen e aftësisë së tyre të vetëripërtëritjes, duke parandaluar gjithashtu diferencimin e tyre, duke e bërë atë një teknologji shumë sfiduese. Në vitet e fundit, një numër i madh eksperimentesh kanë treguar se diferencimi i qelizave staminale hematopoietike varet nga citokinat. Do të përmbledhim shkurtimisht faktorët dhe efektet e tyre të përdorura në kulturën e qelizave staminale hematopoietike.

Faktori i qelizave staminale (SCF)
Faktori i qelizave staminale (SCF) është një faktor që vepron duke ankoruar dhe shprehur receptorin e tirozinës c-Kit në sipërfaqen e të gjitha qelizave staminale të lëvizshme (HSC). Shprehja defektoze e c-Kit çon në një ulje të numrit të zgjerimit të HSC-ve. Aktualisht, pothuajse të gjitha kombinimet e citokinës të përdorura në eksperimentet e kulturës së HSC-ve përmbajnë SCF. Përveç kësaj, si SCF ashtu edhe FL3 i përkasin familjes TKR të receptorit të kinazës së tirozinës, i cili ka një efekt sinergjik në zgjerimin e qelizave hematopoietike primitive. Duke u lidhur me TKR specifik, SCF transmeton sinjale te qelizat, duke filluar ndarjen dhe zgjerimin e hershëm të qelizave paraardhëse, duke lejuar që qelizat të fillojnë zgjerimin dhe duke penguar apoptozën pas përfundimit të fazës G0.

Trombopoietinë（Tpo）
Fillimisht, TPO besohej të ishte një faktor specifik rritjeje për megakariocitet, që i përkiste kategorisë së citokinave me veprim specifik që mund të ruajnë zgjerimin, diferencimin, maturimin, ndarjen dhe formimin e trombociteve funksionale në megakariocite. Është faktori i preferuar për zgjerimin e megakariociteve. Në vitet e fundit, eksperimentet kanë konfirmuar se TPO luan një rol të rëndësishëm në promovimin e zgjerimit të HSC në studimet in vitro, dhe kur kombinohet me citokina të tjera, mund të rrisë numrin total të njësive që formojnë koloni dhe palosjen e zgjerimit të qelizave staminale CD34+. Sidomos në kombinimet FL3, mund të ruajë rritjen dhe zgjerimin afatgjatë të qelizave staminale CD34+ të gjakut të kordonit.

Interleukina-3 (IL-3)
Interleukina-3 (IL-3), e njohur edhe si masQeliza T Faktori i rritjes, është një citokinë pleiotropike e prodhuar kryesisht nga limfocitet T të aktivizuara, e cila mund të stimulojë përhapjen dhe diferencimin e HSC-ve pluripotente dhe qelizave të ndryshme paraardhëse të orientuara nga linja. Pas heterodimerizimit të induktuar nga IL-3 të receptorëve sipërfaqësorë të qelizave staminale, ato mund të lidhen me shumë proteina të transduksionit të sinjalit, të tilla si rruga e transduktorit të sinjalizimit të kinazës Janus dhe aktivizuesit transkriptues (JAK/STAT), duke stimuluar kështu një rrjedhë sinjali të rregulluar në mënyrë të ulët dhe duke marrë pjesë në rregullimin e zgjerimit të qelizave staminale. IL-3 gjithashtu mund të aktivizojë rrugën e kinazës së rregulluar nga sinjali jashtëqelizor (ERK) dhe rrugën e aminotransferazës c-jun (JNK), duke nxitur rritjen, zgjerimin dhe mbijetesën e qelizave staminale.

Interleukina-6 (IL-6)
IL-6 është një citokinë shumëdrejtimëshe që luan një rol të rëndësishëm në mbrojtjen e strehuesit duke rregulluar përgjigjet imune dhe inflamatore. IL-6 prodhohet nga qelizat T, monocitet, fibroblastet, qelizat endoteliale dhe keratinocitet, dhe ka funksione të shumëfishta biologjike. Mund të nxisë diferencimin e qelizave B dhe prodhimin e antitrupave, në mënyrë sinergjike IL-3 luan një rol në zhvillimin e megakariociteve dhe prodhimin e trombociteve, nxit shprehjen e proteinave të fazës akute në mëlçi dhe rregullon metabolizmin e kockave. IL-6 transmeton sinjale përmes sistemit të receptorëve IL-6, i cili përbëhet nga dy zinxhirë: IL-6Rα dhe gp130. STAT3 është molekula vendimtare në ruajtjen e gjendjes së padiferencuar të qelizave staminale embrionale, ndërsa IL-6 është promotori fillestar i rrugës së sinjalizimit JAK/STAT3.

Ligandi LFLT3 (FL)
Ligandi FLT3 është një faktor rritjeje që rregullon zgjerimin e hershëm të qelizave hematopoietike. Ligandi FLT3 lidhet me qelizat që shprehin receptorin e kinazës së tirozinës FLT3. Ligandi FLT3 në vetvete nuk stimulon zgjerimin e qelizave të hershme hematopoietike, por përkundrazi shkakton sinergjikisht rritjen dhe diferencimin me CSF dhe interleukina të tjera. Ndryshe nga SCF, ligandi FLT3 nuk ka efekt në mastocitet. Janë identifikuar nëntipe të shumta të ligandit FLT3. Forma kryesore bioaktive është e ankoruar në sipërfaqen e qelizës si domeni jashtëqelizor i proteinës transmembranore (209a.). Izomeri i lidhur me membranën mund të ndahet nga proteinat për të gjeneruar izomerë të tretshëm biologjikisht aktivë.

FMS-liketyrosine kinease 3
Kineza 3 e tirozinës së ngjashme me FMS (FL3) e shprehur shumë në qelizat CD34+CD38dim transmeton sinjale në qelizë duke u lidhur me receptorët e saj specifikë aktivë të kinazës së tirozinës (TKR). FL3 vepron në HSC/HPC dhe ushtron rregullim hematopoietik duke u lidhur me TKR në sipërfaqen e qelizës. FL3 është gjithashtu një faktor shumë i rëndësishëm stimulues i qelizave të hershme progjenitore, i cili ka një efekt të rëndësishëm nxitës në zgjerimin in vitro të HSC/HPC. Mund të parandalojë që qelizat staminale CD34+ të diferencohen dhe të pakësojnë gradualisht HPC gjatë zgjerimit in vitro.

Faktori transformues i rritjes-β
Faktori transformues i rritjes-β, nëngrupet e faktorit transformues të rritjes-β1, β2 dhe β3 të gjitarëve lëshojnë sinjale përmes të njëjtit receptor, duke shkaktuar përgjigje biologjike të ngjashme. Ato janë citokina shumëfunksionale që rregullojnë zgjerimin, rritjen, diferencimin dhe lëvizjen e qelizave, si dhe sintezën dhe depozitimin e matricës jashtëqelizore. Faktori transformues i rritjes-β (TGF-β) prodhohet nga qelizat stromale të palcës së kockave. Ai pengon hyrjen e HSC/HPC të hershme në fazën S, duke bërë që shumica e HSC/HPC të jenë në fazën G0.

Proteina inflamatore e makrofagëve-1 α
Proteina inflamatore e makrofagëve-1β (MIP-1β) është një antagonist natyror i MIP-1α, i cili mund të shoqërohet me të. Ajo mund të lehtësojë efektin frenues të MIP-1α në HSC/HPC të hershme dhe të parandalojë kthimin e HSC në një gjendje qetësie.

P38
P38, si një molekulë sinjalizuese që i përket familjes së kinazës së proteinave të aktivizuara nga mitogjeni (MAPK), pengon zgjerimin in vitro të HSC-ve në kushte normoksike. Eksperimentet kanë treguar se kur HSC-të shtohen në media kulture pa serum që përmbajnë TPO, SCF dhe FL3, stresi oksidativ aktivizon p38 dhe p16, duke çuar në një rënie të konsiderueshme të numrit të HSC-ve të miut.

Faktori stimulues i kolonive të granulomakrofagëve (GM-CSF)
Faktori stimulues i kolonive të makrofagëve të granulociteve është një ilaç i përdorur klinikisht për shkaqe të ndryshme të leukopenisë ose granulocitopenisë. Agjenti aktual i mobilizimit të qelizave është faktori stimulues i kolonive të makrofagëve të granulociteve (GM-CSF), i cili jo vetëm që rrit numrin e qelizave staminale hematopoietike në gjakun periferik, por gjithashtu ndihmon në funksionin kardiak dhe funksione të tjera.

Faktori stimulues i kolonive të granulociteve (G-CSF)
Efektet e faktorëve stimulues të kolonive të granulociteve në përgjithësi përfshijnë prezantimin e antigjenit, rritjen e funksionit të makrofagëve dhe nxitjen e zgjerimit të qelizave staminale hematopoietike. Faktori stimulues i kolonive të granulociteve është një agjent i fuqishëm mobilizimi për qelizat staminale të palcës së kockave, i cili mund të stimulojë zgjerimin e qelizave staminale autologe të palcës së kockave dhe t'i mobilizojë ato nga palca e kockave në gjakun periferik.

Eritropoietina (EPO)
Eritropoietina (EPO) është faktori kryesor stimulues në diferencimin hematopoietik, i cili mund të nxisë diferencimin e qelizave staminale hematopoietike në qeliza të kuqe primitive të gjakut, të përshpejtojë ndarjen dhe zgjerimin e qelizave të kuqe të gjakut të reja, të nxisë sintezën e hemoglobinës dhe gjithashtu të luajë një rol të rëndësishëm në studimin e diferencimit të shkaktuar nga qelizat e kuqe të gjakut.
Qelizat burimore hematopoietike kanë potencialin për vetëripërtëritje dhe diferencim shumëdrejtimësh. Kombinimi i faktorëve të ndryshëm ka efekte të ndryshme në zgjerimin e qelizave burimore hematopoietike. Përdorimi i qelizave burimore hematopoietike mund të nxisë në mënyrë selektive prodhimin e qelizave të shumëfishta, gjë që padyshim ofron ide të reja për zgjerimin e qelizave NK. Aktualisht, qelizat NK mund të induktohen nga qelizat burimore embrionale dhe qelizat iPSC, por si qelizat burimore embrionale ashtu edhe qelizat burimore pluripotente të induktuara duhet të transformohen në qeliza burimore hematopoietike përpara se të mund të diferencohen në qeliza NK. Prandaj, qelizat burimore hematopoietike luajnë një urë të domosdoshme në këtë proces. Avantazhet e qelizave NK të nxjerra nga qelizat burimore janë se ato mund të përdoren sipas kërkesës, kanë homogjenitet të fortë, lirim të ulët të citokinës dhe aktivitet të fortë vrasës. Prandaj, ende ekziston një entuziazëm i lartë për të eksploruar qelizat NK të nxjerra nga qelizat burimore në treg. Ekzistojnë literaturë mbi induksionin e qelizave burimore në qeliza NK. Ne përqendrohemi kryesisht në faktorët e përmendur në literaturë.

1. Qelizat NK të nxjerra nga qelizat burimore embrionale njerëzore

HESC-të u transferuan në bashkëkulturë me linjën qelizore stromale të palcës së kockave murine M210-B4 në medium që përmbante RPMI 1640, 15% serum fetal të përcaktuar të gjedhit, 2 mM L-glutaminë, 1% aminoacide joesenciale, 1% penicilinë/streptomiocinë dhe 0.1 mM merkaptoetanol me ndryshime të mediumit çdo 2 deri në 3 ditë siç është përshkruar më parë. Pas 17 deri në 20 ditësh, u përgatit pezullimi me një qelizë të vetme dhe qelizat CD34+CD45+ u izoluan, siç është përshkruar më parë. Qelizat e izoluara u transferuan në një bashkëkulturë të dytë me linjën qelizore stromale AFT024 të prejardhur nga mëlçia fetale miunë në medium që përmbante një përzierje 1:2 të mediumit Eagle të modifikuar Dulbecco/Ham F12, 20% serum njerëzor AB të inaktivuar nga nxehtësia, 2 mM L-glutaminë, 1% penicilinë/streptomiocinë, 5 ng/mL selenit natriumi, 50μM etanolaminë, 25μM merkaptoetanol, 20 mg/mL acid askorbik, interleukinë-3, faktor qelizash staminale, IL-15, ligand tirozinë kinazë 3 të ngjashme me Fms dhe IL-7. Qelizat u ushqyen me medium të freskët me gjysmë ndryshimesh të mediumit çdo 5 deri në 6 ditë. Pas 30 deri në 35 ditësh në kulturë, qelizat u mblodhën, u filtruan përmes filtrit 70-μm dhe u përdorën për analiza të mëtejshme.

2. Qelizat NK të nxjerra nga qelizat staminale pluripotente njerëzore

Ne mbledhim qeliza 18-21 ditë për pasurimin e qelizave paraardhëse CD34+ CD45+. Njëqind mijë qeliza CD34+ CD45+ u vendosën në stromën EL08-1D2 me 1 ml citokina inicuese të qelizave NK (IL-3, IL7, IL-15, faktor qelizash staminale dhe ligand i receptorit-3 të kinazës së tirozinës të ngjashme me fms). Kulturat e qelizave NK i rifreskuam me 0.5 ml medium që përmban citokina çdo 4-5 ditë. Qelizat e pjekura NK u matën në ditët 28-35 të kulturës në EL08-1D2.

Citokinat dhe faktori i rritjes që lidhen me qelizat staminale T&L

Rreth T&L
T&L Biotechnology Ltd., e themeluar në vitin 2011, përqendrohet në kërkimin dhe zhvillimin e lëndëve të para dhe reagentëve të gradës GMP për terapinë qelizore dhe gjenetike (CGT). Ne angazhohemi të ofrojmë produkte dhe shërbime të besueshme për shkencën e jetës.