Hematopoietik Kök Hücre Kültüründe Yer Alan Protein Faktörlerinin Özeti

Kaynak: T&L Biotechnology Yayınlanma zamanı: 2023-07-13

giriiş
Son yıllarda, Kök Hücres klinik uygulamalarda giderek daha yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Ancak, insan vücudundaki kök hücrelerin oranı ve miktarı son derece düşüktür ve bu da klinik ihtiyaçları karşılayamaz. Bu nedenle, kök hücrelerin in vitro genişletilmesi ve yetiştirilmesi giderek daha önemli hale gelmiştir. Etik ve teknolojik nedenlerden dolayı, kök hücrelerin tedavisi hala birçok sorunla karşı karşıyadır. Hematopoietik kök/progenitor hücrelerin ve çeşitli kan hücresi soylarının yüzey belirteçleri nispeten açıktır ve hücrelerin fenotipik özellikleri, sinir, damar ve cerrahi transplantasyon için "biyolojik iskeleler" gibi karmaşık alt akış süreçlerine ihtiyaç duyulmadan niceliksel olarak seçilebilir, ayrılabilir ve işlevleri nispeten serbest olabilir. Bu nedenle, kök hücre genişlemesi ve farklılaşması için en iyi modeldir ve ayrıca doğrudan klinik kullanım için uygundur.
Hematopoietik kök hücreler yüksek derecede kendini yenileme ve çoklu farklılaşma potansiyellerine sahiptir. Kırmızı kan hücreleri, beyaz kan hücreleri, trombositler ve lenfositler gibi tüm olgun kan hücrelerini üretebilir ve tüm hematopoietik sistemi yeniden inşa edebilirler. Hematopoietik kök hücrelerin in vitro genişlemesi, kendini yenileme yeteneklerini korurken aynı zamanda farklılaşmalarını da önlemeyi gerektirir ve bu da onu oldukça zorlu bir teknoloji haline getirir. Son yıllarda, çok sayıda deney, hematopoietik kök hücrelerin farklılaşmasının sitokinlere bağlı olduğunu göstermiştir. Hematopoietik kök hücre kültüründe kullanılan faktörleri ve etkilerini kısaca özetleyeceğiz.

Kök hücre faktörü (SCF)
Kök hücre faktörü (SCF), tüm HSC'lerin yüzeyindeki tirozin reseptörü c-Kit'i sabitleyerek ve ifade ederek etki eden bir faktördür. Kusurlu c-Kit ifadesi, HSC genişlemesinin sayısında azalmaya yol açar. Şu anda, HSC kültür deneylerinde kullanılan sitokin kombinasyonlarının neredeyse tamamı SCF içerir. Ek olarak, hem SCF hem de FL3, ilkel hematopoietik hücrelerin genişlemesinde sinerjik bir etkiye sahip olan tirozin kinaz reseptörü TKR ailesine aittir. SCF, spesifik TKR'ye bağlanarak hücrelere sinyaller iletir, progenitör hücrelerin erken bölünmesini ve genişlemesini başlatır, hücrelerin genişlemeye başlamasını ve G0 fazını tamamladıktan sonra apoptozu engellemesini sağlar.

Trombopoietin（Tpo）
TPO'nun başlangıçta megakaryositler için spesifik bir büyüme faktörü olduğuna ve megakaryositlerde fonksiyonel trombositlerin genişlemesini, farklılaşmasını, olgunlaşmasını, bölünmesini ve oluşumunu sürdürebilen spesifik etkili sitokinler kategorisine ait olduğuna inanılıyordu. Megakaryositlerin genişlemesi için tercih edilen faktördür. Son yıllarda yapılan deneyler, TPO'nun in vitro çalışmalarda HSC genişlemesini teşvik etmede önemli bir rol oynadığını ve diğer sitokinlerle birleştirildiğinde toplam koloni oluşturan birim sayısını ve CD34+ kök hücrelerinin genişleme katını artırabileceğini doğruladı. Özellikle FL3 kombinasyonlarında kordon kanı CD34+ kök hücrelerinin uzun vadeli büyümesini ve genişlemesini sürdürebilir.

İnterlökin-3 (IL-3)
İnterlökin-3 (IL-3), aynı zamanda mas olarak da bilinirT hücresi büyüme faktörü, esas olarak aktive edilmiş T lenfositler tarafından üretilen, pluripotent HSC'lerin ve farklı soy yönelimli progenitör hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasını uyarabilen bir pleiotropik sitokindir. IL-3'ün kök hücre yüzey reseptörlerinin heterodimerizasyonuna neden olmasından sonra, Janus kinaz sinyal transdüseri ve transkripsiyonel aktivatör (JAK/STAT) yolu gibi birçok sinyal iletim proteinine bağlanabilir, böylece aşağı düzenlenmiş bir sinyal akışını uyarabilir ve kök hücre genişlemesinin düzenlenmesine katılabilir. IL-3 ayrıca hücre dışı sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) yolunu ve c-jun aminotransferaz (JNK) yolunu aktive ederek kök hücrelerin büyümesini, genişlemesini ve hayatta kalmasını sağlayabilir.

İnterlökin-6 (IL-6)
IL-6, bağışıklık ve inflamatuar yanıtları düzenleyerek konak savunmasında önemli bir rol oynayan çok yönlü bir sitokindir. IL-6, T hücreleri, monositler, fibroblastlar, endotel hücreleri ve keratinositler tarafından üretilir ve birden fazla biyolojik işlevi vardır. B hücresi farklılaşmasını ve antikor üretimini destekleyebilir, sinerjik olarak IL-3, megakaryositlerin gelişiminde ve trombosit üretiminde rol oynar, karaciğerde akut faz proteinlerinin ekspresyonunu indükler ve kemik metabolizmasını düzenler. IL-6, iki zincirden oluşan IL-6 reseptör sistemi aracılığıyla sinyalleri iletir: IL-6Rα ve gp130. STAT3, embriyonik kök hücrelerin farklılaşmamış durumunu korumada belirleyici moleküldür, IL-6 ise JAK/STAT3 sinyal yolunun ilk promotörüdür.

LFLT3 ligandı (FL)
FLT3 ligandı, erken hematopoietik hücre genişlemesini düzenleyen bir büyüme faktörüdür. FLT3 ligandı, tirozin kinaz reseptörü FLT3'ü ifade eden hücrelere bağlanır. FLT3 ligandı, erken hematopoietik hücrelerin genişlemesini kendisi uyarmaz, bunun yerine diğer CSF'ler ve interlökinlerle sinerjik olarak büyümeyi ve farklılaşmayı teşvik eder. SCF'nin aksine, FLT3 ligandı mast hücreleri üzerinde hiçbir etkiye sahip değildir. FLT3 ligandının birden fazla alt tipi tanımlanmıştır. Ana biyoaktif form, transmembran proteinin hücre dışı alanı olarak hücre yüzeyine sabitlenmiştir (209a.). Membran bağlı izomer, biyolojik olarak aktif çözünür izomerler üretmek için proteinler tarafından parçalanabilir.

FMS-Çin meyan kökü 3
CD34+CD38dim hücrelerinde yüksek oranda ifade edilen FMS-liketyrosine kinease 3 (FL3), hücreye özgü tirozin kinaz aktif reseptörlerine (TKR'ler) bağlanarak sinyaller iletir. FL3, HSC/HPC üzerinde etki eder ve hücre yüzeyindeki TKR'ye bağlanarak hematopoietik düzenleme uygular. FL3 ayrıca, HSC/HPC'nin in vitro genişlemesi üzerinde önemli bir teşvik edici etkiye sahip olan çok önemli bir erken progenitör hücre uyarıcı faktördür. CD34+ kök hücrelerinin in vitro genişleme sırasında kademeli olarak farklılaşmasını ve HPC'yi tüketmesini önleyebilir.

Dönüştürücü büyüme faktörü-β
Dönüştürücü büyüme faktörü-β、Memelilerin dönüştürücü büyüme faktörü-β 1 β 2 ve β 3 alt tipleri aynı reseptör aracılığıyla sinyaller yayar ve benzer biyolojik tepkilere neden olur. Hücre genişlemesini, büyümesini, farklılaşmasını ve hareketini ve ayrıca hücre dışı matrisin sentezini ve birikimini düzenleyen çok işlevli sitokinlerdir. Dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β), kemik iliği stromal hücreleri tarafından üretilir. Erken HSC/HPC'nin S fazına girmesini engeller ve çoğu HSC/HPC'nin G0 fazında olmasına neden olur.

Makrofaj inflamatuar protein-1 α
Makrofaj inflamatuar protein-1β (MIP-1β), MIP-1α'nın doğal bir antagonistidir ve buna eşlik edebilir. MIP-1α'nın erken HSC/HPC üzerindeki inhibitör etkisini hafifletebilir ve HSC'nin durgun bir duruma dönmesini önleyebilir.

S38
Mitogen aktive protein kinaz (MAPK) ailesine ait bir sinyal molekülü olan P38, normoksik koşullar altında HSC'lerin in vitro genişlemesini engeller. Deneyler, HSC'ler TPO, SCF ve FL3 içeren serumsuz kültür ortamına eklendiğinde oksidatif stresin p38 ve p16'yı aktive ettiğini ve bunun da fare HSC'lerinin sayısında önemli bir azalmaya yol açtığını göstermiştir.

Granülomakrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)
Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör, lökopeni veya granülositopeninin çeşitli nedenleri için klinik olarak kullanılan bir ilaçtır. Mevcut hücre mobilizasyon ajanı, sadece periferik kandaki hematopoietik kök hücre sayısını artırmakla kalmayıp aynı zamanda kardiyak fonksiyona ve diğer fonksiyonlara da yardımcı olan granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktördür (GM-CSF).

Granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF)
Granülosit koloni uyarıcı faktörlerin etkileri genellikle antijen sunumu, makrofaj fonksiyonunun artırılması ve hematopoietik kök hücre genişlemesinin teşvik edilmesini içerir. Granülosit koloni uyarıcı faktör, kemik iliği kök hücreleri için güçlü bir mobilizasyon ajanıdır ve otolog kemik iliği kök hücrelerinin genişlemesini uyarabilir ve bunları kemik iliğinden periferik kana mobilize edebilir.

Eritropoietin (EPO)
Eritropoietin (EPO), hematopoietik farklılaşmada ana uyarıcı faktördür, hematopoietik kök hücrelerin ilkel kırmızı kan hücrelerine farklılaşmasını destekleyebilir, genç kırmızı kan hücrelerinin bölünmesini ve genişlemesini hızlandırabilir, hemoglobin sentezini destekleyebilir ve ayrıca kırmızı kan hücresi kaynaklı farklılaşmanın incelenmesinde önemli bir rol oynar.
Hematopoietik kök hücreler kendini yenileme ve çok yönlü farklılaşma potansiyeline sahiptir. Farklı faktörlerin birleşimi hematopoietik kök hücrelerin genişlemesi üzerinde farklı etkilere sahiptir. Hematopoietik kök hücrelerin kullanımı seçici olarak birden fazla hücrenin üretimini indükleyebilir ve bu da şüphesiz NK hücrelerinin genişlemesi için yeni fikirler sağlar. Şu anda NK hücreleri embriyonik kök hücrelerden ve iPSC'lerden indüklenebilir, ancak hem embriyonik kök hücreler hem de indüklenen pluripotent kök hücrelerin NK hücrelerine farklılaşmadan önce hematopoietik kök hücrelere dönüştürülmesi gerekir. Bu nedenle hematopoietik kök hücreler bu süreçte vazgeçilmez bir köprü görevi görür. Kök hücrelerden türetilen NK hücrelerinin avantajları talep üzerine kullanılabilmeleri, güçlü homojenliğe, düşük sitokin salınımına ve güçlü öldürme aktivitesine sahip olmalarıdır. Bu nedenle, piyasada kök hücrelerden türetilen NK hücrelerini keşfetmeye yönelik hala yüksek bir ilgi vardır. Kök hücrelerin NK hücrelerine indüksiyonu hakkında literatürler vardır. Biz esas olarak literatürde belirtilen faktörlere odaklanıyoruz.

1. İnsan embriyonik kök hücrelerinden elde edilen NK hücreleri

HESC'ler, daha önce açıklandığı gibi her 2 ila 3 günde bir ortam değişikliğiyle RPMI 1640, %15 tanımlanmış fetal dana serumu, 2 mM L-glutamin, %1 esansiyel olmayan amino asitler, %1 penisilin/streptomiyosin ve 0,1 mM -merkaptoetanol içeren ortamda fare kemik iliği stromal hücre dizisi M210-B4 ile birlikte kültüre aktarıldı. 17 ila 20 gün sonra, tek hücre süspansiyonu hazırlandı ve daha önce açıklandığı gibi CD34+CD45+ hücreler izole edildi. İzole edilen hücreler, Dulbecco modifiye Eagle ortamı/Ham F12, %20 ısıyla inaktifleştirilmiş insan serumu AB, 2 mM L-glutamin, %1 penisilin/streptomiyosin, 5 ng/mL sodyum selenit, 50 μM etanolamin, 25 μM -merkaptoetanol, 20 mg/mL askorbik asit, interlökin-3, kök hücre faktörü, IL-15, Fms benzeri tirozin kinaz 3 ligandı ve IL-7'nin 1:2 karışımını içeren ortamda fare fetal karaciğerinden türetilen stromal hücre dizisi AFT024 ile ikinci bir kokültüre aktarıldı. Hücreler her 5 ila 6 günde bir yarı ortam değişimi ile taze ortamla beslendi. Kültürde 30 ila 35 gün sonra hücreler toplandı, 70 μm'lik filtreden süzüldü ve daha ileri analiz için kullanıldı.

2. İnsan pluripotent kök hücrelerinden türetilen NK hücreleri

CD34+ CD45+ progenitör hücre zenginleştirmesi için 18-21 günlük hücreleri hasat ediyoruz. Yüz bin CD34+ CD45+ hücre, 1 ml NK hücre başlatıcı sitokinler (IL-3, IL7, IL-15, kök hücre faktörü ve fms benzeri tirozin kinaz reseptör-3 ligandı) ile EL08-1D2 stromasına yerleştirildi. NK hücre kültürlerini her 4-5 günde bir 0,5 ml sitokin içeren ortamla yeniledik. Olgun NK hücreleri, EL08-1D2'de kültürün 28-35. günlerinde ölçüldü.

T&L kök hücreyle ilişkili sitokinler ve büyüme faktörü

T&L Hakkında
2011 yılında kurulan T&L Biotechnology Ltd., hücre ve gen terapisi (CGT) için üst düzey GMP sınıfı ham maddelerin ve reaktiflerin araştırma ve geliştirilmesine odaklanmaktadır. Yaşam bilimleri için güvenilir ürünler ve hizmetler sunmayı taahhüt ediyoruz